Beta

Dec 11, 2023

Kommunikationsmedizin Band 3, Artikelnummer: 75 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Seit Beginn der COVID-19-Pandemie sind mehrere besorgniserregende Varianten (VOC) aufgetreten, für die es Hinweise auf eine erhöhte Übertragbarkeit, einen schwereren Krankheitsverlauf und/oder eine verringerte Wirksamkeit des Impfstoffs gibt. Um eine breite Schutzimmunität gegen aktuelle und zukünftige VOC zu erreichen, sind wirksame COVID-19-Impfstoffstrategien erforderlich.

Wir führten Immunogenitäts- und Challenge-Studien an Makaken und Hamstern mit einer bivalenten rekombinanten Impfstoffformulierung durch, die die präfusionsstabilisierten SARS-CoV-2-Spike-Trimere des angestammten D614 und der Beta-Variantenstämme mit AS03-Adjuvans (CoV2 preS dTM-AS03) in einem Primärversuch enthielt Impfeinstellung.

Wir zeigen, dass eine Primärimmunisierung mit dem bivalenten CoV2 preS dTM-AS03 im Vergleich zum Vorfahren breitere und dauerhafte (1 Jahr) neutralisierende Antikörperreaktionen gegen VOC, einschließlich Omicron BA.1 und BA.4/5, und SARS-CoV-1 hervorruft Monovalente Impfstoffe der D614- oder Beta-Variante bei naiven nichtmenschlichen Primaten. Darüber hinaus bietet die bivalente Formulierung Schutz vor viralen Belastungen mit dem SARS-CoV-2-Prototyp-Stamm D614G sowie Alpha- und Beta-Variantenstämmen bei Hamstern.

Unsere Ergebnisse zeigen das Potenzial einer Beta-haltigen bivalenten CoV2 preS dTM-AS03-Formulierung, eine breite und dauerhafte Immunogenität sowie Schutz vor VOC in naiven Populationen bereitzustellen.

SARS-CoV-2 hat sich im Laufe der Zeit verändert, was zu verschiedenen Formen des Virus, sogenannten Varianten, geführt hat. Diese Varianten gefährden den Schutz der COVID-19-Impfstoffe, die eine Immunantwort gegen das virale Spike-Protein auslösen, das es dem Virus ermöglicht, sich an menschliche Zellen anzuheften und diese zu infizieren, da ihre Spike-Proteine ​​unterschiedlich sind. Hier haben wir einen Impfstoff entwickelt und getestet, der zwei verschiedene Spike-Proteine ​​enthält, eines vom ursprünglichen Wuhan-Stamm und eines von der Beta-Variante. Bei Makaken führt der Impfstoff zur Produktion von Antikörpern, die alle getesteten Varianten, einschließlich Omicron, daran hindern können, menschliche Zellen zu infizieren, wobei die Werte über ein Jahr stabil bleiben. Bei Hamstern schützte der Impfstoff vor einer Infektion mit dem Ahnenvirus und den Alpha- und Beta-Varianten. Unsere Ergebnisse haben wichtige Auswirkungen auf die Impfkontrolle bestehender und zukünftiger besorgniserregender SARS-CoV-2-Varianten.

Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), das für die Coronavirus-Krankheit (COVID-19) verantwortlich ist, trat Ende 2019 auf. In den ersten sechs Monaten der Pandemie trat eine Variante mit einer einzelnen Mutation im Spike-Antigen (D614G) auf ), ersetzte den zirkulierenden angestammten Wuhan-Stamm (D614). Die relative genetische Stabilität endete jedoch nach dem ersten Jahr, als besorgniserregende Varianten (VOC), die mehrere Mutationen im Spike-Antigen aufwiesen, den vorherigen Stamm sukzessive verdrängten und weltweit mehrere Infektionswellen verursachten. Es wurden mehrere VOC identifiziert (Alpha, Beta, Gamma, Delta und Omicron BA.1) sowie sehr unterschiedliche Untervarianten von Omicron, von denen einige vom Europäischen Zentrum für die Prävention und die Kontrolle von Krankheiten (BA.) als neue VOC eingestuft wurden. 4 und BA.5)1. Die Entwicklung von SARS-CoV-2 schreitet schneller voran als bisher angenommen und wird nun hauptsächlich durch Immunflucht vorangetrieben, wie die hohe Inzidenz symptomatischer Omicron-Erkrankungen bei geimpften Personen zeigt2. Obwohl in Rekordzeit mehrere Impfstoffe zur Verwendung zugelassen wurden, waren alle zugelassenen Impfstoffe ursprünglich für den Angriff auf den Stammstamm D614 konzipiert3,4.

Es ist mittlerweile allgemein anerkannt, dass SARS-CoV-2 endemisch ist und einen unvorhersehbaren Schweregrad aufweist5. Daher besteht ein dringender ungedeckter Bedarf an optimierten, variantensicheren COVID-19-Impfstoffen, die einen breiten und dauerhaften Schutz gegen bestehende und zukünftige Varianten bieten.

Aufgrund des kontinuierlichen schnellen Ersatzes von BA.1 durch andere Omicron-Unterlinien (BA.2, BA.2.12.1, BA.4, BA.5, BQ.1, BQ.1.1 …), was zu einer ähnlichen höheren Immunflucht führt und Übertragungsraten als BA.16,7,8,9 müssen die aktuellen Impfstrategien zur Jagd auf jede neue Variante neu bewertet werden, sowohl für Auffrischungsdosen als auch für die Grundimmunisierung10,11. Tatsächlich müssen Impfstoffstrategien der nächsten Generation einen wirksamen Schutz für die ungeimpfte und naive Bevölkerung, wie zum Beispiel kleine Kinder, die einem Risiko für künftig zirkulierende VOC12 ausgesetzt sind, berücksichtigen.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass lösliche präfusionsstabilisierte Spike-Trimere (CoV2 preS dTM), die auf der mit dem AS03-Adjuvans formulierten D614-Sequenz basieren, bei naiven Erwachsenen ein günstiges Sicherheitsprofil und eine hohe Immunogenität gegen den Stammstamm hervorrufen13. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass bei vorbereiteten Makaken eine Auffrischungsdosis von CoV2 preS dTM-AS03 (D614 oder Beta) die neutralisierenden Antikörper (nAbs) gegen das Stammvirus verstärkte und die Neutralisierung auf mehrere VOC (Alpha, Beta, Gamma, Delta) ausweitete , und Omicron) und SARS-CoV-114,15. Vorläufige Daten aus zwei klinischen Studien, in denen CoV2 preS dTM-AS03 als Auffrischungsimpfung bei mit einer COVID-19-Impfung geimpften Personen untersucht wurde, bestätigten diese Ergebnisse und legten außerdem die Überlegenheit der monovalenten Beta-Impfstoffformulierungen im Vergleich zu monovalenten D614-mRNA- oder Untereinheiten-Impfstoffen nahe16,17.

Hier berichten wir über die Immunogenität und den Schutz einer bivalenten rekombinanten Impfstoffformulierung, die die präfusionsstabilisierten Spike-Trimere der Stammstämme D614 und Beta (B.1.351) in einer primären Immunisierungsumgebung bei Makaken und Hamstern enthält. Die Beta-Spike-Sequenz wurde aufgrund ihrer signifikanten Immunflucht gegenüber den Prototyp-impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern ausgewählt, die hauptsächlich den drei RBD-Mutationen (K417N, E484K und Y501N) zugeschrieben wird18,19,20,21. Naive Javaneraffen und Hamster wurden mit monovalenten (D614 oder Beta) oder bivalenten (D614 + Beta) CoV2 preS dTM-AS03-Impfstoffkandidaten geimpft, um die neutralisierenden Antikörperreaktionen gegen impfstoffhomologe Stämme, eine breite Palette von VOC, einschließlich Omicron-Subvarianten und SARS, zu bewerten -CoV-1 sowie Gedächtnis-B-Zellen und Dauerhaftigkeit der neutralisierenden Antikörperreaktionen. Der durch die Beta-haltigen Impfstoffformulierungen verliehene Schutz wurde an geimpften Hamstern nach einer Herausforderung mit den Prototyp-Varianten D614G, Alpha oder Beta bewertet.

Unsere Daten zeigen, dass die Primärimmunisierung mit dem ancestral/Beta bivalenten CoV2 preS dTM-AS03-Impfstoffkandidaten dauerhafte neutralisierende Antikörperreaktionen für bis zu 1 Jahr hervorruft, mit der breitesten Abdeckung gegen SARS-CoV-2 VOC, einschließlich Omicron BA.1 und BA.4 /5 sowie gegen SARS-CoV-1 bei naiven nichtmenschlichen Primaten (NHPs) und bietet Schutz gegen den Prototyp D614G, die Alpha- oder Beta-Variante bei Hamstern.

Impfstoffkandidaten CoV2 preS dTM D614 oder Beta mit AS03-Adjuvans und formuliert als monovalente oder bivalente Impfstoffe wurden zuvor in Lit. beschrieben. 14,22.

Kurz gesagt bestehen CoV2-preS-dTM-Impfstoffkandidaten aus einem stabilisierten präfusionstrimeren rekombinanten SARS-CoV-2-S-Protein. Das CoV2 preS dTM (D614) und Beta wurden auf der Grundlage der Wuhan-Sequenzen YP_009724390.1 und B.1.351 (GISAID Accession EPI_ISL_1048524) mit zwei Prolinen in der S2-Domäne, einer Mutation der Furin-Spaltungsstelle und einem Ersatz der Transmembran entwickelt Region durch die T4-Foldon-Trimerisierungsdomäne. Die CoV2 preS dTM D614 oder Beta wurden mithilfe einer von Sanofi entwickelten Zellkulturtechnologie hergestellt, die auf dem Insektenzell-Baculovirus-Expressionssystem basiert. Die CoV2 preS dTM D614 oder Beta werden mit dem AS03-Adjuvans von GSK formuliert.

Die für die Challenge verwendeten SARS-CoV-2-Virusbestände wurden bei Bioqual aus Samen hergestellt, die vom Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository (BEI Resources) bezogen wurden. Der SARS-CoV-2 USA/NY-PV08449/2020 (D614G)-Bestand wurde vom BEI-Saatbestand NR-53515 abgeleitet und erhielt die Chargennummer 091620-230. Der Stammtiter beträgt 9,8 × 104 TCID50/ml (in VeroE6) und 5 × 107 TCID50/ml in Vero TMPRSS2. Der Stamm der SARS-CoV-2-Alpha-Variante (B.1.1.7) wurde aus dem BEI-Saatgutstamm NR-54011 abgeleitet und erhielt die Chargennummer 012921-1230. Der Stammtiter beträgt 1,58 × 107TCID50/ml und 1,38 × 106 PFU/ml in Vero TMPRSS2. Der Stamm der SARS-CoV-2-Beta-Variante (B.1.351) wurde aus dem BEI-Saatgutstamm NR-54974 abgeleitet und erhielt die Chargennummer 030621-750. Der Stammtiter wurde in VeroE6- und Vero TMPRSS2-Zellen sowohl über den TCID50- als auch über den Plaque-Assay bestimmt. Der Titer beträgt 5 × 105 TCID50/ml in VeroE6 und 1,99 × 108 TCID50/ml in Vero TMPRSS2.

Reporterviruspartikel (RVPs)-GFP, die im Lentivirus-basierten Pseudovirus-Neutralisationstest verwendet wurden, wurden von Integral Molecular erhalten (Tabelle 1).

293T-hsACE2-Klonzellen (Integral Molecular, Kat.-Nr. C-HA102), die für den Lentivirus-basierten Pseudovirus-Neutralisierungstest verwendet wurden, wurden von Integral Molecular erhalten und gemäß den Anweisungen des Herstellers gezüchtet.

Vero TMPRSS2-Zellen (erhalten von Adrian Creanga, Vaccine Research Center-NIAID) wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10 % fötales Rinderserum (FBS) + Gentamicin gezüchtet.

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit allen einschlägigen Vorschriften der US-amerikanischen National Institutes of Health gemäß genehmigten Tierprotokollen des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in den Forschungseinrichtungen durchgeführt. Die NHP-Studie wurde an der University of Louisiana im Lafayette New Iberia Research Center durchgeführt und die Hamsterstudie wurde bei Bioqual durchgeführt.

Cynomolgus-Makaken im Alter von 2–8 Jahren wurden nach Geschlecht, Alter und Gewicht randomisiert. Die Gruppen bestanden aus sechs Tieren, darunter zwei oder drei Weibchen und vier oder drei Männchen. Makaken wurden am D0 und D21 intramuskulär in den Deltamuskel mit verschiedenen Impfstoffformulierungen (mit AS03-Adjuvans) geimpft: monovalenter angestammter Spike D614 (5 oder 10 µg), monovalenter Beta-Variante Spike (5 oder 10 µg) oder bivalenter D614 + Beta (5 µg + 5 µg) (Abb. 1). Zwei weitere Gruppen erhielten das monovalente D614 (5 µg) auf D0 und einen heterologen Impfstoff auf D21, der entweder aus monovalentem Beta (5 µg) oder bivalentem D614 + Beta (5 µg + 5 µg) bestand.

Fünf Gruppen von sechs Javaneraffen wurden am Tag 0 (D0) und am Tag 21 (D21) intramuskulär mit CoV2 preS dTM-AS03-Impfstoffkandidaten immunisiert. Die monovalenten Impfstoffkandidaten D614 und Beta (B.1.351) der Vorfahren wurden in zwei verschiedenen Antigendosen verwendet: 5 und 10 µg. Der bivalente Kandidat D614 + Beta wurde in einer Menge von 5 µg + 5 µg verwendet.

Vor der Immunisierung wurden Blutproben an D0 und D21 sowie an D34, D70, D114, D206 und D365 entnommen.

Weibliche Goldhamster im Alter von 6–8 Wochen wurden nach dem Gewicht randomisiert. Impfstoffkandidaten wurden am Tag 0 und am Tag 21 intramuskulär in den Quadrizeps des Hinterbeins verabreicht. Vierundzwanzig Hamster pro Gruppe wurden entweder mit monovalentem D614 zu 1 µg oder Beta zu 1 µg oder mit bivalentem D614 + Beta zu 1 µg + 1 µg geimpft. Blutproben wurden vor der Immunisierung (Tag 0 und Tag 21) und am Tag 35 entnommen. Achtundzwanzig Tage nach der zweiten Dosis wurden 8 Hamster pro Gruppe auf intranasalem Weg mit dem NY-Stamm (D614G) bei 9,8 × 103 TCID50 (VeroE6) oder Beta bei 5 × 102 TCID50 (VeroE6) oder Alpha bei 1,6 × 106 TCID50 provoziert , (Vero TMPRSS2) infektiöse Dosen, von denen zuvor festgestellt wurde, dass sie 7 Tage nach der Infektion zu einem Verlust von 10–20 % des Körpergewichts führen. Das Körpergewicht wurde bis zum Ende der Studie täglich überwacht, d. h. 4 oder 7 Tage nach der Belastung für die Hälfte der Tiere pro Gruppe und Zeitpunkt. Die Lungen wurden 4 oder 7 Tage nach der Exposition zur Beurteilung der Viruslast und der Pathologie entnommen.

Ein Rekonvaleszenz-Humanserum-Panel (N = 93) wurde von kommerziellen Anbietern (Sanguine Biobank, iSpecimen und PPD) bezogen. Die Serumproben wurden innerhalb von 3 Monaten nach der PCR-positiven Diagnose von COVID-19 im Jahr 2020 entnommen.

Der internationale WHO-Standard für Anti-SARS-CoV-2-Immunglobulin (Mensch) (NIBSC-Code: 20/136) wurde ebenfalls verwendet, um die genaue Kalibrierung von Tests auf eine beliebige Einheit zu ermöglichen, wodurch die Abweichungen zwischen Laboren reduziert und eine gemeinsame Sprache geschaffen wurden zum Melden von Daten.

Der Assay wurde zuvor in Lit. beschrieben. 14. Die Varianten Mu (B.1.621) und Omicron BA.4/5 wurden dem Panel der Pseudoviren hinzugefügt (Tabelle 1).

Serumproben wurden 1:4 oder 1:20 in Medium (FluoroBrite phenolrotfreies DMEM + 10 % FBS + 10 mM HEPES + 1 % PS + 1 % Glutamax) verdünnt und 30 Minuten lang bei 56 °C hitzeinaktiviert. Darüber hinaus wurde eine zweifache 11-Punkte-Verdünnungsreihe des hitzeinaktivierten Serums in den Medien durchgeführt. Verdünnte Serumproben wurden mit Reporterviruspartikel (RVP)-GFP (Integral Molecular) gemischt, das in der folgenden Tabelle (Tabelle 1) aufgeführt ist, verdünnt, um etwa 300 infektiöse Partikel pro Vertiefung zu enthalten, und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. 96-Well-Platten mit ~50 % konfluenten klonalen 293T-hsACE2-Zellen (Integral Molecular, Kat.-Nr. C-HA102) in einem Volumen von 75 µL wurden mit 50 µL der Serum- und Virusmischungen beimpft und 72 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Am Ende der 72-stündigen Inkubation wurden die Platten mit einem High-Content-Imager gescannt und einzelne GFP-exprimierende Zellen gezählt. Der neutralisierende Antikörpertiter wurde als Kehrwert der Verdünnung angegeben, die die Anzahl der Virusplaques im Test um 50 % reduzierte.

Der qualifizierte Test auf das vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) und das angestammte D614-Pseudovirus (Nexelis, Laval, Kanada) wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, pseudotypisierte Viruspartikel wurden aus einem modifizierten Vesikulären Stomatitis-Virus (VSVΔG)-Rückgrat hergestellt, das den SARS-CoV-2-Spike (Wuhan) trägt und den Luciferase-Reporter zum Nachweis exprimiert. Zweifache Reihenverdünnungen hitzeinaktivierter Seren wurden mit 75.000–300.000 relativen Lumineszenzeinheiten (RLU) gemischt und 60 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Mischung wurde dann auf 96-Well-Platten übertragen, die zuvor über Nacht mit VeroE6-Zellen ausgesät wurden, und 20 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach der Zugabe des Luciferase-Substrats wurden die Platten auf einem Spectramax 340PC Versamax auf Lumineszenz untersucht. Die in RLU quantifizierte Intensität der Lumineszenz ist umgekehrt proportional zu den im Serum vorhandenen neutralisierenden Antikörpern. Die Titer neutralisierender Antikörper wurden als Kehrwert der Serumverdünnung berechnet, was zu einer 50-prozentigen Reduzierung des RLU führte, gemessen in Abwesenheit von Serum.

S-spezifische IgGs wurden mittels indirektem ELISA getestet. Nunc-Mikrowellplatten wurden über Nacht bei 4 °C mit Spike SARS-CoV S-GCN4-Protein (GeneArt, ausgedrückt in der Zelllinie Expi 293) in einer Konzentration von 0,5 µg/ml in PBS beschichtet. Die Platten wurden dreimal mit 0,1 % PBS-Tween gewaschen, bevor sie 1 Stunde lang mit 1 % BSA in 0,1 % PBS-Tween blockiert wurden. Hitzeinaktivierte Proben wurden mit einer Anfangsverdünnung von 1:450 ausplattiert, gefolgt von dreifachen Siebenpunkt-Reihenverdünnungen in Blockierungspuffer. Die Platten wurden nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur dreimal gewaschen, bevor ein sekundärer Antikörper hinzugefügt wurde. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal gewaschen. Die Platten wurden mit Pierce 1-Step Ultra TMB-ELISA-Substratlösung 6 Minuten lang entwickelt und mit TMB STOP-Lösung gestoppt. Die Platten wurden bei 450 nm in einem SpectraMax®-Plattenlesegerät gelesen und die Daten mit der Software Softmax® Pro 6.5.1 GxP und der proprietären Software Sanofi Universal Exporter 2.1 analysiert. Die Antikörpertiter wurden als höchste Verdünnung angegeben, die einem Cutoff von 0,2 OD entspricht.

Gedächtnis-B-Zellen wurden mit dem Human IgG Single-color B cell ELISpot Kit (CTL, CAT# NC1911372) analysiert. Kryokonservierte PBMCs wurden schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad aufgetaut. Eine Mischung aus fötalem Kälberserum (FCS)/DNAse I (200 Einheiten/ml) wurde langsam zu den PBMCs gegeben, bevor sie in ein vollständiges Zellkulturmedium (CM) (RPMI-1640 mit 10 % FCS und Antibiotika-Cocktail) überführt wurde. Nach Zentrifugation und Resuspension in 6 ml CM wurden die PBMCs in Platten mit sechs Vertiefungen überführt und 1 Stunde lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Dann wurde B-Poly-STM in einer Verdünnung von 1:1000 zur Zellstimulation für 4 Tage bei 37 °C mit 5 % CO2 hinzugefügt.

Vorstimulierte PBMCs wurden geerntet und 5 Minuten lang bei 433 × g bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Nach dem Waschen wurden die PBMCs mit dem Guava® easyCyte-Zellzähler gezählt und die Zellen mit CM auf die gewünschte Konzentration eingestellt.

Platten mit 96 Wells und PVDF-Membran wurden maximal 1 Minute lang mit 15 μl 70 %igem Ethanol permeabilisiert, dann dreimal mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 1X gewaschen, bevor sie mit 80 μl menschlichem Ig-Fängerantikörper beschichtet wurden (Ab) verdünnt im Verhältnis 1:50 oder mit SARS-CoV2 S-GCN4-Protein, Stamm Wuhan (GeneArt, exprimiert in Expi 293-Zelllinie) oder Stamm BA.5 (Sino Biologicals, exprimiert in HEK293-Zellen) bei 4 µg/ml oder mit PBS. Die Platten wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert und dann dreimal mit sterilem PBS und mit CM für 1 Stunde bei RT gewaschen. CM wurde dann entfernt und PBMCs wurden mit 3 × 105 Zellen/Vertiefung in die mit S-GCN4-Protein (Stamm Wuhan oder BA.5) und PBS beschichteten Vertiefungen und mit 5 × 103 Zellen in die mit Ig-Einfang-Ab beschichteten Vertiefungen zugegeben. unter 100 μL/Well. Jede Bedingung wurde doppelt getestet und die Platten wurden 18 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.

Um Antikörper-sezernierende Zellen aufzudecken, wurden die Platten zunächst zweimal mit PBS, dann zweimal mit 0,05 % Tween-PBS gewaschen und dann wurde Anti-Human-IgG-Nachweislösung unter 80 µl hinzugefügt. Nach 2-stündiger Inkubation bei RT wurden die Platten dreimal mit 0,05 % Tween PBS gewaschen und eine Tertiärlösung unter 80 µL hinzugefügt. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei RT inkubiert, dann zweimal mit 0,05 % Tween PBS und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Eine blaue Entwicklerlösung wurde unter 80 µL zugegeben und 15–20 Minuten bei RT inkubiert. Die Reaktion wurde durch dreimaliges Spülen der Plattenmembran mit Wasser und Dekantieren gestoppt. Die Platten wurden an der Luft getrocknet, dann gescannt und mit dem Cytation 7-Analysegerät ausgelesen. Die Anzahl der Spots nur mit PBS (Hintergrund) wurde von der Anzahl der S-spezifischen oder gesamten IgG-Spots abgezogen. Die Ergebnisse werden als S-spezifische IgG-sekretierende B-Gedächtniszellen pro Million PBMCs und als Prozentsatz der S-spezifischen IgG-sekretierenden B-Gedächtniszellen unter allen zirkulierenden IgG-sekretierenden B-Gedächtniszellen ausgedrückt.

THP-1-Zellen (ATCC) wurden in RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) gehalten, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 5 % Penicillin/Streptomycin (Corning, 50 µg/ml), 5 % L-Glutamin (Corning). , 4 mM), 5 % HEPES-Puffer (pH 7,2) (Corning, 50 mM) und 0,5 % 2-Mercaptoethanol (Gibco, 275 µM) bei 37 °C, 5 % CO2. ADCP wurde wie zuvor in Lit. beschrieben durchgeführt. 23. Kurz gesagt, D614 Spike, Beta Spike oder Omicron Spike (Sino Biological) wurden biotinyliert und an gelbgrüne NeutrAvidin FluoSpheres (Invitrogen) gekoppelt. Immunkomplexe wurden durch Mischen von Antigen-gekoppelten Kügelchen mit 1:100 in PBS verdünntem Serum gebildet. Immunkomplexe wurden 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und in PBS gewaschen. THP-1-Zellen wurden den Immunkomplexen in einer Konzentration von 1,25 × 105 Zellen/ml zugesetzt und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Fähigkeit von Antikörpern, die Kügelchenaufnahme durch THP-1-Zellen voranzutreiben, wurde mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines BD LSR II-Zytometers beurteilt. PhagoScores wurden wie folgt berechnet: (% Perle + Zellen × GeoMean der Zellen)/10000. Die Proben wurden im Duplikat getestet und die Daten stellen den Durchschnitt der Duplikate dar.

ADNP wurde wie zuvor in Lit. beschrieben durchgeführt. 24. Peripheres Vollblut wurde vom Ragon Institute von gesunden Freiwilligen gesammelt. Die Freiwilligen legten eine unterschriebene Einwilligung vor, waren über 18 Jahre alt und wurden anonymisiert. Die Studie wurde vom MGH Institutional Review Board genehmigt. Rote Blutkörperchen wurden durch Ammoniumchlorid-Kalium-Lyse (ACK) lysiert. Weiße Blutkörperchen wurden mit PBS gewaschen und in RPMI-1640-Medium (Sigma-Aldrich), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (Sigma-Aldrich), 5 % Penicillin/Streptomycin (Corning, 50 µg/ml), 5 gehalten % L-Glutamin (Corning, 4 mM), 5 % HEPES-Puffer pH 7,2 (Corning, 50 mM) und 37 °C, 5 % CO2 für die Dauer des Tests. Gelbgrüne NeutrAvidin FluoSpheres wurden wie für ADCP beschrieben an Antigen gekoppelt. Immunkomplexe wurden durch Mischen von 1:50 in PBS verdünntem Serum mit gekoppelten Perlen und 2-stündiges Inkubieren bei 37 °C gebildet. Immunkomplexe wurden gewaschen und weiße Blutkörperchen in einer Konzentration von 2,5 × 105 Zellen/ml hinzugefügt. Die Zellen wurden 1 Stunde lang bei 37 °C mit Immunkomplexen inkubiert. PacBlue Anti-CD66b (BioLegend, Klon: UCH71) wurde zur Anfärbung von Neutrophilen verwendet. Die Phagozytose wurde mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines iQue (Intellicyt) gemessen. Die Phagozytose durch Neutrophile (CD66b+) wurde wie für ADCP beschrieben berechnet. Das Experiment wurde mit zwei Spendern durchgeführt und der angegebene Wert ist der Durchschnitt der beiden Spender.

ADCD wurde wie zuvor in Lit. beschrieben durchgeführt. 25. Rote NeutrAvidin-FluoSpheres wurden wie für ADCP beschrieben an Antigen gekoppelt. Immunkomplexe wurden durch Mischen von 1:10 in PBS verdünntem Serum mit gekoppelten Perlen und 2-stündiges Inkubieren bei 37 °C gebildet. Die Immunkomplexe wurden gewaschen und lyophilisiertes Meerschweinchenkomplement (Cedarlane), verdünnt in Gelatine-Veronalpuffer mit Calcium und Magnesium (Sigma-Aldrich), zu den Immunkomplexen gegeben und 20 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die C3-Ablagerung wurde mit Anti-Meerschweinchen-C3-FITC (MpBio) gemessen. Die Fluoreszenz wurde mit einem BD LSR II-Zytometer erfasst. Die C3-Ablagerung wird als mittlere Fluoreszenzintensität von FITC angegeben. Das Experiment wurde doppelt durchgeführt und der angegebene Wert ist der Durchschnitt der beiden Wiederholungen.

ADNKA wurde wie zuvor in Lit. beschrieben durchgeführt. 26. ELISA-Platten wurden mit 2 µg/ml Antigen beschichtet und 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Platten wurden mit PBS gewaschen und über Nacht mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) bei 4 °C blockiert. Buffy Coats wurden vom Massachusetts General Hospital von gesunden Spendern gesammelt, die über 18 Jahre alt waren und eine unterzeichnete Einwilligung vorlegten. Die Proben wurden vor der Verwendung anonymisiert. NK-Zellen wurden mit RosetteSep (STEMCELL Technologies) aus Buffy Coats isoliert und dann mit einem Ficoll-Gradienten getrennt. NK-Zellen wurden über Nacht bei 37 °C, 5 % CO2 in R10-Medium (RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (Sigma-Aldrich), 5 % Penicillin/Streptomycin (Corning, 50) ruhen gelassen µg/ml), 5 % L-Glutamin (Corning, 4 mM), 5 % HEPES-Puffer (pH 7,2) (Corning, 50 mM)), ergänzt mit 2 ng/ml IL-15. Am folgenden Tag wurden die Platten gewaschen und 1:25 in PBS verdünnte Proben zu den Platten gegeben. Die Platten wurden 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, gewaschen und NK-Zellen wurden in einer Konzentration von 2,5 × 05 Zellen/ml in R10-Medium, ergänzt mit Anti-CD107a–Phycoerythrin (PE)–Cy5 (BD Biosciences, Chargennr. 0149826), zugegeben , 1:1000 Verdünnung), Brefeldin A (10 µg/ml) (Sigma-Aldrich) und GolgiStop (BD Biosciences). Die Platten wurden 5 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen auf Oberflächenmarker mit Anti-CD3 Pacific Blue (BD Biosciences, Klon G10F5), Anti-CD16-Allophycocyanin (APC)-Cy5 (BD Biosciences, Klon 3G8) und Anti-CD56 PE-Cy7 (BD) gefärbt Biowissenschaften, Klon B159) für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die Zellen wurden mit PermA (Life Technologies) fixiert und mit PermB (Life Technologies) permeabilisiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur mit Anti-MIP-1β PE (BD Biosciences) und Anti-IFN-Gamma-FITC gefärbt. Die Fluoreszenz wurde mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines BD LSR II analysiert. NK-Zellen wurden als CD56 + CD16 + CD3− identifiziert und die Aktivität wurde als Prozentsatz der NK-Zellen bestimmt, die positiv für CD107a, MIP-1b oder IFNg waren. Der Test wurde mit zwei Spendern durchgeführt und die gemeldeten Daten stellen den Durchschnitt der beiden Spender dar.

Antigenspezifischer Antikörper-Isotyptiter und Fc-Rezeptor (FcR) – die Bindung wurde durch einen Multiplex-Luminex-Assay bestimmt, wie zuvor in Lit. beschrieben. 27. Carboxylierte Megaplex-Mikrosphären (Luminex) wurden über NHS-Ester-Bindungen durch Zugabe von Sulfo-NHS und EDC (Thermo Fisher) kovalent an Antigene gebunden. Immunkomplexe wurden durch Zugabe eines verdünnten Serums zu antigengekoppelten Mikrokügelchen gebildet und die Platten wurden über Nacht bei 4 °C unter Schütteln bei 700 U/min inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Platten mit 0,1 % BSA und 0,02 % Tween-20 gewaschen. Zum Nachweis des Antikörper-Isotyp-Titers wurden den Platten PE-gekoppelte Maus-Anti-Human-Nachweisantikörper (Southern Biotech) zugesetzt. Zum Nachweis der FcR-Bindung wurden mit Avi markierte menschliche FcRs (Duke Human Vaccine Institute) unter Verwendung eines BirA500-Kits (Avidity) gemäß den Anweisungen des Herstellers biotinyliert und mit Streptavidin-PE markiert. Der PE-markierte FcR wurde dem Immunkomplex hinzugefügt. Die Fluoreszenz wurde mit einem iQue (Intellicyt) erfasst und die Daten stellen die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) dar. Der Luminex-Assay wurde im Duplikat durchgeführt und die gemeldeten Daten stellen den Durchschnitt der Duplikate dar. Jeder Luminex-Assay wurde mit mehreren Verdünnungen für dasselbe Antigen durchgeführt. Es wurden repräsentative Daten angezeigt.

Der TCID50-Assay wurde durch Zugabe zehnfach abgestufter Probenverdünnungen zu TMPRSS2-Monoschichten durchgeführt. Konkret wurden Vero TMPRSS2-Zellen (erhalten von Adrian Creanga, Vaccine Research Center-NIAID) mit 25.000 Zellen/Well in DMEM + 10 % FBS + Gentamicin ausplattiert und die Kulturen bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert. Das Medium wurde abgesaugt und durch 180 μl DMEM + 2 % FBS + Gentamicin ersetzt. Zwanzig (20) μL der Probe wurden in vierfacher Ausfertigung in die obere Reihe gegeben und fünfmal mit einer P200-Pipettiermaschine gemischt. Mit der Pipette wurden 20 μl in die nächste Reihe übertragen und auf der Platte wiederholt (Spalten A–H), was zehnfachen Verdünnungen entspricht. Die Spitzen wurden für jede Reihe entsorgt und bis zur letzten Reihe wiederholt. In jedem Testaufbau waren positive (Virusstamm mit bekanntem Infektionstiter im Test) und negative (nur Medium) Kontrollvertiefungen enthalten. Die Platten wurden 4 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Zellmonoschichten wurden visuell auf zytopathische Wirkung (CPE) untersucht. Der TCID50-Wert wurde mithilfe der Read-Muench-Formel berechnet. Für Proben mit weniger als 3 CPE-positiven Vertiefungen konnte der TCID50 nicht mithilfe der Reed-Muench-Formel berechnet werden, und diesen Proben wurde ein Titer unterhalb der Nachweisgrenze zugewiesen (d. h. Testprototyp D614G 1,569 TCID50/Gramm, Testalpha 1,652). TCID50/Gramm und Challenge Beta 1.550 TCID50/Gramm). Für eine optimale Testleistung sollte der TCID50-Wert der Positivkontrolle innerhalb des Zweifachen des erwarteten Wertes liegen.

Ganze Lungenproben des linken Hamsters wurden in 10 % neutral gepuffertem Formalin (NBF) gesammelt, routinemäßig verarbeitet und in Paraffin eingebettet. Paraffinblöcke wurden auf etwa 5 Mikrometer geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Ein staatlich geprüfter Veterinärpathologe untersuchte H&E-Objektträger blind sowohl qualitativ als auch semiquantitativ auf Lungenpathologie. Basierend auf dem Prozentsatz der betroffenen Lungen wurden semiquantitative Bewertungen vorgenommen. Lungen, die mit normalem Gewebe übereinstimmten, erhielten eine Bewertung von 0. Wenn weniger als 25 % des Abschnitts eine Histopathologie aufwiesen, wurde eine Bewertung von 1 vergeben. Eine Bewertung von 2 wurde den Lungenabschnitten zugeschrieben, in denen in mehr als 25 %, aber weniger als 50 % der Lunge histopathologische Veränderungen auftraten. Wenn mehr als 50 % des Lungenparenchyms betroffen waren, wurde ein Wert von 3 vergeben. Die Nukleokapsid-Proteinexpression wurde durch DAB-Chromogen-basierte Immunhistochemie mit einem polyklonalen Kaninchen-Anti-SARS-CoV-2-Nukleokapsid-Antikörper (GTX135357, GeneTex, Inc, USA) in der automatisierten Immunfärbungsplattform Leica BondRX (Leica, USA) wie zuvor beschrieben28 bewertet. Die immunpositive Nucleocapsid-Fläche wurde in Lungenschnitten unter Verwendung eines prozentualen Flächenalgorithmus der HALO-Bildanalysesoftware (Indica Labs, USA) gemessen.

Die Aussagekraft der Studie wurde auf der Grundlage des Pseudovirus-neutralisierenden Titers geschätzt, wobei berücksichtigt wurde, dass der minimale relevante Unterschied dem Dreifachen (0,5 log) entsprach, mit einer Standardabweichung von 0,3 log (dh wie in früheren Studien beobachtet). In diesem Zusammenhang wurde eine Stichprobengröße von 6 NHP pro Gruppe als akzeptabel angesehen, um einen Unterschied zwischen den 11 Gruppen mit einer Aussagekraft von mehr als 75 % zu zeigen.

Zum Zeitpunkt der Zuordnung waren die Merkmale zu Studienbeginn (Geschlecht, Alter und Gewicht) ausgeglichen, um vergleichbare Gruppen zu haben. ELISA-Titer und neutralisierende Titer wurden vor der statistischen Analyse log10-transformiert.

Alle statistischen Tests waren zweiseitig, das nominale Niveau der statistischen Signifikanz wurde auf α = 0,05 für Effektgrößenschätzungen, α = 0,01 für Normalitätstests und α = 0,10 für Interaktionsterme festgelegt. Die Analysen wurden auf SEG SAS v9.4® durchgeführt.

Für alle Ergebnisse der NHP-Studien und die ELISA-Titer der Hamsterstudie wurden Analysen mit gemischten Modellen durchgeführt, wobei Produkt, Zeit und ihre Interaktion als feste Faktoren, eine Zeit als wiederholt betrachtet und Kohorten als zufälliger Effekt für den Hamster hinzugefügt wurden Studie. Für neutralisierende Titer der Hamster-Studie sowie Omicron BA.5 Spike-spezifische IgG-sekretierende Gedächtnis-B-Zell-Antworten der NHP-Studie, da nur Daten zu einem Zeitpunkt verfügbar waren, wurde eine einfaktorielle ANOVA unter Verwendung eines gemischten Modells mit einem Produkt wie Es wurde ein fester Faktor und Kohorten als Zufallseffekt durchgeführt. Die Normalität des Residuums des Modells wurde mithilfe eines Normalwahrscheinlichkeitsdiagramms überprüft und die Ergebnisse wurden als akzeptabel angesehen.

Es wurde eine Spearman-Korrelation zwischen PsV-Titern und Gewichtsverlust durchgeführt.

Für die univariate Systemserologieanalyse wurden die Statistiken mit GraphPad Prism Version 8.0 berechnet. Die Signifikanz wurde durch einen Kruskal-Wallis-Test bestimmt. Heatmaps und Polardiagramme wurden in Python (Version 3.9.1) erstellt. Die Polardiagramme zeigen den mittleren Perzentilrang für jedes Merkmal. Die Heatmaps zeigen die Z-Score-Daten.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Wir prüften zunächst, ob eine mögliche Immuninterferenz zwischen den beiden Valenzen in der bivalenten Formulierung im Vergleich zu den monovalenten D614- oder Beta-Formulierungen besteht. Naive Javaneraffen wurden am Tag 0 und 21 mit der bivalenten CoV2 preS dTM-AS03-Impfstoffformulierung (D614 + Beta) in einer Dosis von 5 µg + 5 µg oder mit den monovalenten CoV2 preS dTM-AS03-Impfstoffen (D614 oder Beta) in einer Dosis von 5 µg und 10 µg immunisiert µg-Dosen (Abb. 1).

Neutralisierende Antikörperreaktionen gegen den angestammten Wuhan-Stamm D614 und Beta VOC wurden zwei Wochen nach der zweiten Dosis mithilfe von Lentivirus-basierten Pseudovirus-Assays (Lentivirus-PsV) analysiert. Der bivalente Impfstoffkandidat löste hohe und konsistente nAb-Titer gegen das angestammte SARS-CoV-2 D614 aus, mit mittleren Titern von 3,0 log10 ± 0,4 log10 Standardabweichung (SD) (ergänzende Abbildung 1a), die sich nicht signifikant von denen unterscheiden, die durch das monovalente D614 induziert werden bei 5 µg (mittlere Titer von 3,1 log10) und 10 µg (mittlere Titer von 3,4 log10), aber deutlich höher als diejenigen, die durch den monovalenten Beta-Impfstoff bei 10 µg hervorgerufen werden (mittlere Titer von 2,3 log10, P = 0,0017, mittlerer Anstieg um das 4,9-fache). ). Das Fehlen negativer Immunstörungen in der bivalenten Formulierung wurde mithilfe eines qualifizierten D614-Vesikulären-Stomatitis-Virus (VSV)-Pseudovirus-Assays bestätigt (ergänzende Abbildung 1b).

Wie erwartet löste der bivalente Impfstoff bei allen Makaken auch hohe und konsistente nAb-Titer gegen Beta-Pseudovirus aus, mit einem Mittelwert von 3,0 log10 ± 0,3 log10 SD, was den Werten entspricht, die durch den monovalenten Beta-Impfstoff bei 5 µg und 10 µg induziert werden (ergänzende Abb. 1c) und deutlich höher als diejenigen, die durch das monovalente D614 bei 10 µg induziert werden (siebenfacher mittlerer Anstieg, P < 0,001).

Insgesamt induzierte das bivalente CoV2 preS dTM-AS03 robuste und ausgewogene nAb-Titer sowohl gegen den D614-Vorfahrenstamm als auch gegen die Beta-Variante, ohne erkennbare Immunstörungen.

Als nächstes beurteilten wir die Breite der Neutralisierung, die der bivalente Impfstoff gegen andere VOC, D614G, Alpha und Delta (alle mit der ursprünglichen E484-Position), Gamma und Mu (mit der in Beta vorhandenen E484K-Mutation) und den weiter entfernten Omicron BA verleiht. 1 (enthält die E484A-Mutation unter 15 Mutationen in der RBD) und SARS-CoV-1. Der bivalente Impfstoff wurde zum gleichen Zeitpunkt (dh 2 Wochen nach der zweiten Dosis) mit den monovalenten Impfstoffformulierungen verglichen (Abb. 2a).

Gruppen von sechs naiven Makaken wurden zweimal im Abstand von drei Wochen mit dem bivalenten Impfstoff (5 µg + 5 µg), monovalentem D614 oder monovalentem Beta (10 µg) immunisiert. Die Titer neutralisierender Antikörper wurden 2 Wochen nach der zweiten Dosis gemessen. ein Lentivirus-basierter Pseudovirus-neutralisierender Antikörpertiter gegen den Vorläufer D614 und den Prototyp D614G, besorgniserregende Varianten (Alpha, Beta, Gamma, Delta, Mu und Omicron BA.1) und SARS-CoV-1 2 Wochen nach Dosis 2 . Es wurden einzelne Makakendaten angezeigt. b Eine Reihe menschlicher Rekonvaleszenzseren (N = 93) wurde gegen das angestammte Pseudovirus D614 getestet und wird als Vergleichsprobe aufgetragen. Die gestrichelte Linie stellt den Internationalen Standard der Weltgesundheitsorganisation (WHO) für Anti-SARS-CoV2-Immunglobulin (Mensch) dar, NIBSC-Code: 20/136. Horizontale gepunktete Linien zeigen die Quantifizierungsgrenzen des Tests an. Balken stellen Mittelwerte und 95 %-Konfidenzintervalle dar.

Der bivalente Impfstoff löste hohe und homogene nAb-Titer gegen alle VOC – außer Omicron BA.1 – mit mittleren Titern zwischen 2,8 log10 gegen Delta und 3,5 log10 gegen Gamma aus. Im Vergleich zum monovalenten D614-Impfstoff (10 µg) löste der bivalente Impfstoff äquivalente nAb-Titer gegen D614, D614G, Alpha und Delta (mittlere Titer von 3 bis 3,5 log10), aber höhere nAb-Titer gegen Beta, Gamma und Mu aus ( mittlere Titer von 2,2 bis 2,4 log10, P < 0,001, mittlerer Anstieg von 6,1 auf 12,2). Umgekehrt induzierte der bivalente Impfstoff im Vergleich zum monovalenten Beta-Impfstoff höhere nAb-Titer gegen D614, D614G, Alpha und Delta (mittlere Titer von 2,1 bis 2,5 log10, mittlerer Anstieg um das Vielfache von 3,3 auf 5,8, P < 0,05), aber äquivalente nAb-Titer dagegen Beta, Gamma und Mu (mittlere Titer von 2,9 bis 3,3 log10).

Bei Omicron BA.1 und SARS-CoV-1 induzierte der bivalente Impfstoff bei allen Tieren nachweisbare Titer mit mittleren Titern um 2,0 log10, wohingegen die nAb-Reaktionen in den monovalenten Impfstoffgruppen unterschiedlicher waren.

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der bivalente Vorfahren-/Beta-Impfstoffkandidat robuste und ausgewogene nAb-Reaktionen gegen die ursprünglichen E484-haltigen Viren (D614, D614G, Alpha und Delta), die E484K-haltigen Viren (Beta, Gamma und Mu) und niedrigere hervorruft aber konsistente nAb-Reaktionen gegen das entfernte Omicron BA.1 (E484A) und SARS-CoV-1.

Zum Vergleich: Der bivalente Impfstoff löste mittlere D614-nAb-Titer aus, die höher waren als im Internationalen Standard der Weltgesundheitsorganisation (WHO) für Anti-SARS-CoV-2-Immunglobulin (NIBSC-Code: 20/136; 2,8 log10 in unserem Lentivirus-Pseudovirus-Assay). ) und höher als diejenigen, die in einem Panel von 93 menschlichen Rekonvaleszenzseren gemessen wurden (gesammelt innerhalb von 3 Monaten nach positivem PCR-Test; 2,0 log10; Abb. 2b). Der Internationale Standard für Anti-SARS-CoV-2-Immunglobuline, der am 10. Dezember 2020 vom WHO-Expertenausschuss für biologische Standardisierung angenommen wurde, ermöglicht den Vergleich der in verschiedenen Neutralisationstests erzeugten Titer gegen D614. Ihm wurde eine Wirksamkeit von 1000 UI/ zugewiesen. ml29.

Um den Nutzen einer heterologen Grund-/Booster-Immunisierung bei der Kreuzneutralisierung zu bewerten, wurden zwei alternative Immunisierungsschemata getestet, bei denen auf eine erste Dosis mit dem monovalenten D614 (5 µg) (D0) eine zweite Dosis (D21) mit einem der monovalenten Substanzen folgte Beta- (5 µg) oder bivalente (5 µg + 5 µg) Impfstoffe (ergänzende Abbildung 2a).

Im Vergleich zum 2-Dosen-Regime des monovalenten D614-Impfstoffs konnte die zweite Injektion mit monovalentem Beta die Breite der neutralisierenden Reaktion auf Beta und andere VOC erweitern, während die zweite Injektion mit der bivalenten Dosis die Breite nicht verbesserte. Allerdings induzierte die heterologe Grundierung/Auffrischung mit monovalentem Beta für die zweite Injektion eine höhere Variabilität und etwas niedrigere Titer als das Zwei-Dosen-Regime des bivalenten Impfstoffs (nicht signifikant für die mittleren nAb-Titer D614, D614G, Alpha und Delta, 3- und 4,1- niedriger falten für Beta, P = 0,0165 und Gamma, P = 0,0052 (mittlere nAb-Titer) (ergänzende Abbildung 2b).

Um einem potenziellen Rückgang neutralisierender Antikörper entgegenzuwirken, haben wir die nAb-Titer gegen die Prototypen D614G, Beta und Omicron BA.1 im Blut geimpfter Tiere bis zu einem Jahr nach der Immunisierung (D365) gemessen, wobei die bivalenten und monovalenten Impfstoffformulierungen bei 10 lagen µg Gesamtantigendosis (Abb. 3).

Pseudovirus-neutralisierende Antikörpertiter gegen a den Prototyp D614G SARS-CoV-2, b die Beta-Variante und c die Omicron-Variante (BA.1) wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung von Javaneraffen mit monovalentem D614 (10 µg), monovalent, bewertet Beta (10 µg) oder bivalentes D614 + Beta (5 µg + 5 µg). Es werden einzelne Makakendaten angezeigt (N = 6/Gruppe). Verbindungslinien zeigen mittlere Reaktionen an und die horizontale gepunktete Linie ist die Quantifizierungsgrenze des Tests.

Für jede Impfstoffformulierung erreichten die nAb-Titer gegen den Prototyp D614G und die Beta-Variante ihren Höhepunkt am Tag 34, sanken bis zum Tag 70 oder D114 und blieben dann bis zu einem Jahr lang stabil (D365). Nach einem Jahr betrugen die mittleren nAb-Titer gegen den Prototyp D614G und die Beta-Variante 2,7 bzw. 2,5 log10 für den bivalenten Impfstoff, 2,8 bzw. 1,8 log10 für den monovalenten D614-Impfstoff und 2,4 bzw. 2,6 log10 für den monovalenten Beta-Impfstoff (Abb. 3a, b).

Neutralisierende Titer gegen Omicron BA.1 wurden am Tag 0, D34, D206 und D365 und gegen BA.4/5 nach einem Jahr bestimmt. Alle Tiere hatten bis zu einem Jahr lang nachweisbare BA.1-PsV-nAb-Titer, außer in der Gruppe mit dem monovalenten D614-Impfstoff (Abb. 3c). Die mittleren nAb-Titer gegen Omicron BA.1 (Abb. 3c) und BA.4/5 (Abb. 4) nach einem Jahr betrugen 2,2 bzw. 2,0 log10 für das bivalente, 1,7 bzw. 1,7 log10 für das monovalente D614 und 2,1 und 1,7 log10 für das monovalente Beta.

Pseudovirus-neutralisierende Antikörpertiter gegen Omicron BA.4/5 in einzelnen Makakenseren werden angezeigt (N = 6/Gruppe; eine Probe fehlte in der Beta-monovalenten Impfstoffgruppe). Blaue Diamanten: bivalente D614 + Beta-Formulierung; schwarze Quadrate: D614-Formulierung; Lila Punkte: Beta-Formulierung. Balken zeigen mittlere Reaktionen an und horizontale gepunktete Linien entsprechen dem Kehrwert der niedrigsten Verdünnung des Tests.

Die mittleren Alpha- und Gamma-nAb-Titer nach 3 Monaten (D114) betrugen 2,6 bzw. 2,6 log10 für die bivalenten Impfstoffgruppen, 2,7 bzw. 2,1 log10 für das monovalente D614, 2,3 bzw. 2,8 log10 für das monovalente Beta (ergänzende Abbildung 3a, B). Die mittleren nAb-Titer der Delta-Variante nach 7 Monaten (D206) betrugen 2,1 log10 (bivalent), 2,2 log10 (monovalentes D614) und 1,8 log10 (monovalentes Beta) (ergänzende Abbildung 3c).

Interessanterweise schien der Rückgang bei kreuzneutralisierenden Reaktionen weniger ausgeprägt zu sein als bei impfstoffhomologen neutralisierenden Reaktionen. Bemerkenswert ist, dass die Kreuzneutralisierungsreaktionen tendenziell bei niedrigeren Titern ihren Höhepunkt erreichten als impfstoffhomologe Neutralisierungsreaktionen (Abb. 3 und ergänzende Abb. 3). Somit war der Unterschied zwischen homologen und heterologen Neutralisierungstitern ein Jahr nach der Immunisierung geringer als zwei Wochen nach der zweiten Dosis. Dies gilt insbesondere für Omicron BA.1, bei dem bei allen drei Impfstoffformulierungen zwischen Tag 34 und einem Jahr kein signifikanter Rückgang der nAb-Titer beobachtet wurde.

Die Modellierung des Ab-Zerfalls auf der Grundlage der experimentellen Daten zeigte, dass die Prototyp-D614G-nAb-Titer nach dem anfänglichen Zerfall in der bivalenten Gruppe auf D98 ein Plateau bei 2,6 log10 erreichten und bis zu einem Jahr stabil blieben (D365). Für die monovalente D614-10-µg-Gruppe wurde bei D89 ein Plateau erreicht, wobei der mittlere Titer auf 2,8 log10 geschätzt wurde. In der monovalenten Beta-10-µg-Gruppe wurde das Plateau bei D34 bei 2,3 log10 erreicht, was darauf hindeutet, dass es in dieser Gruppe innerhalb eines Jahres zu keinem D614G-nAb-Abfall kam.

Die Beta-nAb-Titer erreichten für alle Gruppen ein Plateau und lagen bei geschätzten 2,4 log10 bei D111, 1,8 log10 bei D113 und 2,5 log10 bei D114 für bivalentes, monovalentes D614 bzw. monovalentes Beta.

Bezüglich der Omicron BA.1 nAb-Titer wurde aufgrund der wenigen Zeitpunkte (D34, 206 und 365), die nach der Immunisierung beurteilt wurden, kein mathematisches Modell durchgeführt. Dennoch wurde kein statistisch signifikanter Zeiteffekt von D34 bis 1 Jahr (D365) beobachtet Die neutralisierenden Titer waren über 1 Jahr stabil.

Nach einem Jahr wurden bei allen Tieren in allen drei Impfstoffgruppen, d. h. bivalentes, monovalentes D614 und monovalentes Beta, D614- und Omicron BA.5-Spike-spezifische IgG-sekretierende Gedächtnis-B-Zellreaktionen in ähnlichen Konzentrationen festgestellt (Abb. 5). Bei Anpassung an die gesamten IgG-Gedächtnis-B-Zellen waren die Reaktionen innerhalb der Gruppen sehr homogen. Die Mediane der angestammten D614 S-spezifischen/Gesamt-IgG-sezernierenden Gedächtnis-B-Zellen betrugen 0,46, 0,19 bzw. 0,39 % für die bivalente, monovalente D614- und monovalente Beta-Impfstoffgruppe. Im Vergleich zur monovalenten D614-Formulierung wurden in der bivalenten und monovalenten Beta-Gruppe deutlich höhere angestammte D614-Spike-Memory-B-Zellen nachgewiesen. Die Mediane der Omicron BA.5 S-spezifischen/Gesamt-IgG-sekretierenden Gedächtnis-B-Zellen betrugen 0,21, 0,19 bzw. 0,29 % für die bivalente, monovalente D614- und monovalente Beta-Impfstoffgruppe, ohne signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen.

Spike-spezifische IgG-sekretierende Gedächtnis-B-Zellreaktionen nach einem Jahr, induziert durch die bivalenten und monovalenten CoV2-preS-dTM-AS03-Impfstoffe gegen einen angestammten D614-Spike und b Omicron BA.5-Spike. Die Symbole stellen die individuelle Häufigkeit von S-spezifischen/Gesamt-IgG-sekretierenden Gedächtnis-B-Zellen (%) bei Makaken dar, die mit dem bivalenten Impfstoff (5 µg + 5 µg) (blaue Rauten), monovalentem D614 (10 µg) (schwarze Quadrate) oder immunisiert wurden monovalentes Beta (10 µg) (violette Punkte) und Balken für den Median jeder Gruppe.

Zusätzlich zu neutralisierenden Antikörpern wurden die Fc-Rezeptorbindungs- und Antikörpereffektorfunktionen bewertet, da bereits gezeigt wurde, dass sie zur Beseitigung einer SARS-CoV-2-Infektion beitragen30. Die bivalente Formulierung rief im Vergleich zu den monovalenten Impfstoffformulierungen bei 5 und 10 µg ähnliche IgG1-Titer und FcR2a-bindende Antikörper gegen D614 und Beta Spikes hervor (Abb. 6a, b).

a Die Punktdiagramme zeigen den IgG1-Titer gegen D614- (links) oder Beta-Spike (rechts). b Die Punktdiagramme zeigen den FcR2a-Bindungstiter gegenüber dem angestammten D614 (linke Tafel) oder Beta-Spike (rechte Tafel). c Die Punktdiagramme zeigen die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) gegen angestammtes D614 (links) oder Beta (rechts) Spike. d Die Punktdiagramme zeigen die Antikörper-abhängige Komplementablagerung (ADCD) gegen angestammtes D614 (links) oder Beta (rechts) Spike. e Die Heatmaps zeigen den mittleren Z-Score für alle Antikörpermerkmale, gemessen gegen den angestammten D614 Spike (links) oder Beta Spike (rechts). Die Signifikanz wurde durch einen Kruskal-Wallis-Test und anschließende post-hoc Benjamini-Hochberg-p-Wert-Korrektur für mehrere Vergleiche bestimmt. MFI mittlere Fluoreszenzintensität. a–d Symbole stellen individuelle Werte bei Makaken dar, die mit dem bivalenten Impfstoff (5 µg + 5 µg) (schwarze Punkte), monovalenten Impfstoffen mit 5 µg (rote Punkte) oder monovalenten Impfstoffen mit 10 µg (grüne Punkte) immunisiert wurden, und Balken zeigen den Median jeder Gruppe.

Anschließend haben wir die Fähigkeit der Antikörper aus diesen verschiedenen Impfstoffformulierungen gemessen, zelluläre Effektorfunktionen zu induzieren. Wir fanden heraus, dass die bivalente Formulierung bei 10 µg im Vergleich zur monovalenten Formulierung deutlich weniger Antikörper-abhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) gegen D614 Spike induzierte (Abb. 6c). Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Fähigkeit der Antikörper beobachtet, eine antikörperabhängige Komplementablagerung (ADCD) auszulösen (Abb. 6d).

Um den Unterschied zwischen den bivalenten und monovalenten Formulierungen auf breiter Ebene zu verstehen, haben wir eine Heatmap des Z-Scores aller gemessenen Antikörpertiter, FcR-Bindung und Antikörpereffektorfunktionen gegen D614 (Abb. 6e, linke Felder) oder Beta erstellt (Abb. 6e, rechte Tafel). Diese Analyse ergab kein spezifisches Muster, das die bivalenten von den monovalenten Formulierungen unterscheidet. Diese Daten verdeutlichen, dass die bivalente Formulierung einen robusten Antikörpertiter der IgG-Unterklasse und eine FcR-Bindungsfunktion induziert, vergleichbar mit den monovalenten Formulierungen.

Weitere Analysen der durch die verschiedenen Formulierungen induzierten Effektorfunktionen wurden gegen die Omicron-Variante (BA.1) Spike durchgeführt. Der IgG1-Bindungstiter an den Omicron Spike korrelierte stark mit der IgG1-D614G-Bindung (ergänzende Abbildung 4a), zeigte jedoch eine verringerte Bindung, wie in früheren Studien gezeigt31. Die bivalente Formulierung induzierte Spike-spezifische Antikörper gegen Omicron mit ähnlichen Titern (Ergänzung Abb. 4b) und ähnlicher FcR2a- und FcR3a-Bindung (Ergänzung Abb. 4c) im Vergleich zu den monovalenten Formulierungen D614 und Beta bei 5 und 10 µg. Während alle Formulierungen eine ähnliche antikörperabhängige zelluläre und neutrophile Phagozytose (ADCP bzw. ADNP) induzierten, induzierte die monovalente 10-µg-Beta-Formulierung eine höhere ADCD als die monovalente 5-µg-Beta-Formulierung und zeigte einen höheren Trend als alle anderen Formulierungen (ergänzende Abbildung 4d). . Ob der Anstieg der ADCD-Aktivität einfach auf eine höhere Impfstoffdosis oder die Induktion von IgM gegen Omicron zurückzuführen ist, ist unklar.

Um schließlich zu verstehen, ob die bivalente Impfstoffformulierung eine breitere Antikörperantwort hervorruft, haben wir den mittleren Perzentilrang der IgG1-Titer für die bivalente Formulierung und die vier monovalenten Formulierungen gegen D614G, Omicron, Alpha, Beta und Delta Spike aufgetragen (Ergänzung). Abb. 4e). Diese Analyse legt nahe, dass die bivalente Formulierung und die beiden monovalenten D614- und Beta-Formulierungen bei 10 µg möglicherweise eine breitere IgG-Reaktion bieten als die monovalenten Formulierungen bei 5 µg.

Als nächstes untersuchten wir den Schutz, den der bivalente Impfstoff bei Goldhamstern gegen Virusreplikation und Lungenpathologie bietet, die durch eine Virusbelastung mit den Prototyp-Varianten D614G, Alpha und Beta hervorgerufen werden. Drei Kohorten von 32 Hamstern (jeweils aufgeteilt in vier Gruppen zu je acht Tieren) wurden entweder mit Puffer (Kontrollgruppe), monovalentem D614, monovalentem Beta oder bivalentem (D614 + Beta) CoV2 preS dTM-AS03 unter Verwendung der zwei Dosen immunisiert D0/D21-Regime, intramuskulär mit 1 µg jedes Antigens (Abb. 7a). Vier Wochen nach der zweiten Dosis wurde jede Kohorte entweder mit dem Prototyp D614G, dem Alpha- oder dem Beta-Virus infiziert, wobei infektiöse Dosen verwendet wurden, die zuvor nachweislich einen Körpergewichtsverlust zwischen 10 und 20 % hervorriefen.

ein Studienschema. Hamster wurden am Tag 0 und am Tag 21 mit dem bivalenten D614 + Beta (1 µg + 1 µg) und dem monovalenten D614 oder Beta (1 µg) geimpft. b S-spezifische IgG-Titer wurden bei einzelnen Hamstern getestet, die mit dem bivalenten Impfstoff (blaue Rauten), dem monovalenten D614-Impfstoff (schwarze Quadrate) oder dem monovalenten Beta-Impfstoff (violette Punkte) am Tag 0, 21 (nach der ersten Dosis) immunisiert wurden. und D35 (nach der zweiten Dosis). c PsV-nAb-Titer gegen Prototyp-D614G-, Alpha-, Delta- und Beta-Varianten wurden an D35 in geimpften und nicht geimpften Hamstern getestet. Symbole stellen einzelne Daten dar und Balken zeigen den Mittelwert der Gruppe. Horizontale gepunktete Linien entsprechen dem Kehrwert der niedrigsten Verdünnung der Tests.

Vor der Herausforderung wurden S-spezifische IgG- (ELISA) und nAb-Titer gegen Prototyp D614G, Alpha, Beta und Delta VOC in Seren von geimpften und nicht geimpften Hamstern mithilfe von Lentivirus-Pseudovirus-Assays bewertet. Die unterschiedlichen Impfstoffformulierungen induzierten bei allen Hamstern 21 Tage nach der ersten Injektion S-spezifische IgGs, mit Ausnahme von 1 und 2 Hamstern in den monovalenten D614- und Beta-Impfstoffgruppen. Die mittleren IgG-Titer variierten zwischen 3,2 und 3,5 log10 ELISA-Einheiten (EU), wie in Abb. 7b dargestellt, und waren in allen Impfstoffgruppen vergleichbar. Die mittleren S-spezifischen IgG-Titer stiegen 2 Wochen nach der zweiten Dosis auf ~5,0 log10 EU, ohne statistisch signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Impfstoffformulierungen. In Übereinstimmung mit den früheren Beobachtungen bei Makaken löste die bivalente Impfstoffformulierung hohe und ausgewogene nAb-Titer bei D35 gegenüber den Prototypen D614G, Alpha, Delta und Beta mit mittleren Titern zwischen 2,7 und 3,2 log10 aus (Abb. 7c). Die monovalente D614-Formulierung induzierte hohe und ausgeglichene nAb-Titer gegen die Prototypen D614G, Alpha und Delta (mittlere Titer zwischen 2,9 und 3,1 log10), wohingegen die nAbs gegen Beta niedriger waren (mittlere Titer von 1,5 log10). Es ist bemerkenswert, dass zwei Hamster, die mit dem monovalenten D614-Impfstoff geimpft wurden, zwei Wochen nach der zweiten Dosis niedrige S-spezifische IgG-Titer (3,0 und 4,2 log10 EU) und keine nachweisbaren nAb-Titer aufwiesen. Umgekehrt induzierte die monovalente Beta-Formulierung nur hohe nAb-Titer gegen das homologe Beta-Pseudovirus (mittlere Titer von 3,1 log10) und niedrigere nAb-Titer gegen die Prototypen D614G, Alpha und Delta (mittlere Titer zwischen 1,9 und 2,5 log10; Abb. 7c). Diese Daten stimmen mit unseren Beobachtungen bei Makaken überein, die keine Immuninterferenzen zwischen den beiden Antigenen zeigen.

Statistisch signifikant höhere nAb-Titer gegen Beta wurden bei der bivalenten Formulierung im Vergleich zur monovalenten D614-Formulierung beobachtet (38-fach, P < 0,001) und für den Prototyp D614G (6,5-fach, P < 0,001), Alpha (3,7-fach, P = 0,0144) und Delta (7,3-fach, P < 0,001) nAb-Titer im Vergleich zum monovalenten Beta-Impfstoff.

Um den Schutz gegen Prototyp (D614G) und Varianten (Alpha und Beta) zu beurteilen, wurde die Veränderung des Körpergewichts bis zu 7 Tage nach der Exposition als Marker für das Fortschreiten der Erkrankung überwacht, und die Viruslast und Pathologie der Lunge wurde nach der Autopsie an Tag 4 oder Tag 7 beurteilt die Hälfte der Tiere. Ungeimpfte Hamster (Puffer) verloren 7 Tage nach der Belastung mit Beta und Alpha bis zu 18 % ihres Körpergewichts und nach der Prototyp-D614G-Belastung bis zu 10 % (Abb. 8a), während das Gewicht nicht geimpfter Hamster stabil blieb oder während der Belastung leicht anstieg Gleiche Periode. Mit Ausnahme der beiden Hamster mit geringer Reaktion (ohne nAb-Titer), die mit dem monovalenten Impfstoff D614 geimpft wurden, hatten alle geimpften Hamster, unabhängig von den Impfstoffformulierungen, nach der Exposition ein stabiles oder leicht steigendes Körpergewicht und folgten dem gleichen Profil wie die nicht infizierte Gruppe.

Hamster, die mit dem bivalenten D614 + Beta (1 µg + 1 µg) und dem monovalenten D614 oder Beta (1 µg) geimpft wurden, wurden 28 Tage nach der Impfung (N = 8/Gruppe) mit den Prototypen D614G, Alpha oder Beta-Viren infiziert zweite Dosis. a Die individuelle Veränderung des Körpergewichts wurde täglich während der 7 Tage nach der Belastung beurteilt. Symbole repräsentieren einzelne Daten und Linien den Mittelwert der Gruppe. b Viruslast durch infektiöse Titration, c Pathologie-Score (basierend auf dem Prozentsatz des betroffenen Gewebes: 0 = 0 %; 1 < 25 %; 2 = 25–50 %; 3 > 50 %) und d prozentualer Anteil der Nukleokapsidproteinfläche wurden in bewertet der Lunge eines einzelnen Hamsters, 4 oder 7 Tage nach der Exposition. Die Balken stellen den Median der Gruppe für den Pathologie-Score und den prozentualen Anteil der Nukleokapsid-Proteinfläche dar, die gestrichelte Linie stellt die Nachweisgrenze dar.

Die Viruslast wurde in der Lunge 4 und 7 Tage nach der Exposition (die Hälfte der Tiere pro Gruppe und pro Zeitpunkt) unter Verwendung einer 50 % Gewebekultur-Infektionsdosis-Titration (TCID50) gemessen. In jeder Kohorte zeigte die ungeimpfte Gruppe (Puffer) 4 Tage nach der Exposition hohe Viruslasten mit durchschnittlichen Viruslasten von 8,8 log10, 8,6 log10 und 8,3 log10 TCID50 in der D614G-, Alpha- und Beta-Kohorte (Abb. 8b). . Am Tag 4 nach der Exposition zeigten Hamster, die mit den bivalenten oder monovalenten Beta-Impfstoffen geimpft wurden, eine geringe bis nicht nachweisbare Viruslast, unabhängig vom für die Herausforderung verwendeten Virus (D614G, Alpha oder Beta). Hamster, die mit dem monovalenten D614-Impfstoff geimpft wurden, zeigten ebenfalls niedrige bis nicht nachweisbare Viruslasten auf D4, mit Ausnahme der beiden Hamster in der Alpha-Challenge-Kohorte, die hohe Viruslasten aufwiesen, die mit einem Körpergewichtsverlust einhergingen, und keine nachweisbaren nAb-Titer. Ein mit dem monovalenten D614 geimpfter Hamster zeigte in der mit der Beta-Variante geimpften Kohorte ebenfalls eine hohe Viruslast.

In den drei Kohorten waren die Infektionstiter sieben Tage nach der Infektion niedrig bis nicht mehr nachweisbar.

Als nächstes beurteilten wir die Lungenpathologie 4 und 7 Tage nach der Exposition durch mikroskopische Untersuchung von Lungenschnitten, die mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt oder einer Anti-SARS-CoV-2-Nukleokapsidprotein-Immunhistochemie (IHC) unterzogen wurden. Bei allen drei Virusstämmen bestand die Pathologie bei ungeimpften Hamstern (Puffer) aus multifokalen bis verschmelzenden Regionen entzündlichen Infiltrats, bestehend aus Makrophagen, Lymphozyten, Heterophilen und Synzytialzellen, vermischt mit Blutungen und Zelltrümmern, die häufig die normale Architektur vernichteten (Abb. 9a und ergänzende Abb . 5). Es bestand eine ausgeprägte Typ-II-Pneumozytenhyperplasie und das bronchioläre Epithel war multifokal hyperplastisch, gekennzeichnet durch eine Anhäufung vieler Epithelzellen und durchsetzt mit seltenen nekrotischen Zellen. Die Lumen einiger Bronchiolen enthielten nekrotische Zelltrümmer. Blutgefäße zeigen entweder eine wandförmige oder perivaskuläre Infiltration durch gemischte entzündliche Infiltrate. Die Lungenpathologie wurde bei Hamstern, die die Impfung erhielten, deutlich abgeschwächt. Basierend auf dem Prozentsatz der betroffenen Lunge wurden semiquantitative Bewertungen vorgenommen.

a Repräsentative Mikrofotografien mit geringer Vergrößerung (8x) (H&E). Die Lungen von Hamstern, die nur Puffer, die monovalenten D614- oder Beta- (1 µg) und die bivalenten D614 + Beta-Impfstoffe (1 µg + 1 µg) erhielten, wurden nach H&E-Färbung 7 Tage nach der Exposition mit den Prototypen D614G, Alpha und Beta untersucht Viren. Pfeile = entzündliches Infiltrat, Pneumozytenhyperplasie Typ II, Zelltrümmer, dargestellt durch dunkelviolette Regionen. b Die Nukleokapsid-Proteinexpression wurde durch Immunhistochemie in der Lunge von Hamstern 4 Tage nach der Exposition mit den Prototyp-Viren D614G, Alpha und Beta analysiert.

Alle ungeimpften Hamster hatten 4 Tage nach der Exposition mit dem Prototyp D614G und Alpha einen mittleren Lungenpathologie-Score von 2 (auf einer Skala von 0–3) und einen Score von 1 oder 2 in der mit Beta-Challenge (Abb. 8c). Sieben Tage nach der Belastung schritt die Pathologie bei allen ungeimpften Tieren bis zum Maximalwert von 3 voran, unabhängig vom für die Belastung verwendeten Stamm. Im Gegensatz dazu zeigten Hamster, die mit den monovalenten oder bivalenten Impfstoffen geimpft wurden, am Tag 4 oder 7 nach der Infektion keine oder nur eine minimale Pathologie (Werte von 0 oder 1), mit Ausnahme der beiden Hamster mit geringer Reaktionsfähigkeit, die mit D614 geimpft und mit der Alpha-Variante geimpft wurden. die Werte von 2 und 3 aufwiesen, was mit der hohen Viruslast übereinstimmt. In derselben Kohorte (Alpha-Challenge) zeigte ein Hamster, der mit dem monovalenten Beta geimpft worden war, 4 Tage nach der Challenge einen Wert von 2; Die Post-hoc-Analyse zeigte jedoch, dass die Pathologie weniger entwickelt war als bei den pufferimmunisierten Kontrollen mit ähnlichen Werten. Darüber hinaus zeigte die Immunhistochemie bei ungeimpften Hamstern 4 Tage nach der Exposition eine Nukleokapsid-Proteinexpression in multifokalen bis koaleszierenden Regionen der Lunge, während bei keinem geimpften Hamster zum gleichen Zeitpunkt Nukleokapsid-Protein nachgewiesen wurde, außer bei den beiden Tieren mit geringer Reaktion, die mit dem monovalenten Mittel immunisiert wurden D614-Impfstoff (Abb. 8d, 9b).

Insgesamt gewährten der bivalente D614/Beta-Impfstoff sowie die beiden monovalenten CoV2-preS-dTM-AS03-Impfstoffe (D614 und Beta) Hamstern Schutz vor Körpergewichtsverlust, Virusreplikation in der Lunge und durch den Prototyp D614G, Alpha oder induzierter Lungenpathologie Beta-Varianten.

Die Übertragung von SARS-CoV-2 ist in vielen Teilen der Welt immer noch unkontrolliert, und das Aufkommen impfstoffresistenter Varianten wie Omicron und seinen Untervarianten hat die Grenzen von Impf-Booster-Strategien auf Basis des Wuhan-Urstammstamms D614 deutlich gemacht und die Entwicklung von stimuliert neue Impfstoff-Booster-Formulierungen basierend auf Varianten-Spikes32,33,34,35,36.

Hier untersuchten wir die Immunogenität und Wirksamkeit einer bivalenten rekombinanten CoV2-preS-dTM-Impfstoffformulierung mit AS03-Adjuvans, die die präfusionsstabilisierten Spike-Trimere der Stammstämme D614 und Beta (B.1.351) enthielt, bei naiven NHPs und Hamstern nach einem Jahr Grundimmunisierungsserie. Das NHP-Modell weist eine hohe Vorhersagekraft für die Immunogenität des COVID-19-Impfstoffs auf und der Goldhamster hat sich als Modell der Wahl erwiesen, um die Wirksamkeit des Impfstoffs gegen durch SARS-CoV-2-Varianten verursachte Pathologien zu bewerten37,38.

Die Ergebnisse unserer Studie belegen die breite und dauerhafte Immunogenität, die der auf bivalentem Protein D614/Beta basierende CoV2 preS dTM-AS03-Impfstoff in NHPs bis zu einem Jahr verleiht. Insbesondere induziert der bivalente Impfstoff starke neutralisierende Antikörperreaktionen gegen die impfstoffhomologen Viren (D614, D614G und Beta) sowie Alpha, Gamma, Delta und Mu VOC und erreicht stabile Werte zwischen 3 und 12 Monaten. Wichtig ist, dass der bivalente Impfstoff auch kreuzneutralisierende Antikörper gegen SARS-CoV-1 aus dem Ausbruch von 2003 sowie konsistente und anhaltende kreuzneutralisierende Antikörper gegen Omicron BA.1 und BA.4/5 hervorruft. Wir haben auch die Induktion hoher Mengen Spike-spezifischer Gedächtnis-B-Zellen (Vorfahren D614 und Omicron BA.4/5) ein Jahr nach der Immunisierung mit den drei Formulierungen gemessen. Darüber hinaus verringerte die Kombination der beiden Antigene (D614 und Beta CoV2 preS dTM) in der bivalenten Impfstoffformulierung die Immunogenität beider Antigene im Vergleich zu den monovalenten Formulierungen nicht. Die durch die bivalente Formulierung hervorgerufenen umfangreichen Kreuzneutralisierungsreaktionen lassen sich durch die additive Wirkung der beiden Impfstoffkomponenten erklären, die hinsichtlich der Neutralisierung von Varianten gegensätzliche Profile aufweisen. Tatsächlich induziert der monovalente Impfstoff D614 kreuzneutralisierende Antikörper gegen D614G, Alpha und Delta, die die ursprüngliche Aminosäure E484 enthalten, während der monovalente Impfstoff Beta kreuzneutralisierende Antikörper gegen Gamma und Mu induziert, die die E484K-Mutation enthalten, die für den Großteil des Antikörperaustritts verantwortlich ist20 . Die konsequente Neutralisierung der viel weiter entfernten Omicron-Variante (mit E484A-Mutation) könnte das Ergebnis eines komplementären oder synergistischen Effekts auf konservierte Epitope sein, die in jedem monovalenten Impfstoff subdominant sein könnten39,40.

Um die Neutralisierungsergebnisse zu ergänzen, zeigten umfangreiche systemische serologische Analysen, dass die bivalente Formulierung im Vergleich zu jeder monovalenten Formulierung insgesamt ähnliche IgG-Unterklassen und Fc-Funktionen hervorrief.

Als wir das Zwei-Dosen-Immunisierungsschema mit dem bivalenten Impfstoff mit alternativen heterologen Immunisierungsschemata mit monovalentem D614 gefolgt von monovalenten Beta- oder bivalenten Impfstoffen verglichen, induzierte interessanterweise nur die zweite Injektion mit monovalentem Beta ausgewogene neutralisierende Reaktionen und mit einer höheren Variabilität als zwei Dosen mit dem bivalenten Impfstoff. Die geringere Leistung des heterologen Prime/Boost wurde auch bei Mäusen beobachtet, bei denen im Vergleich zu zwei Mäusen niedrigere nAbs (Vorfahren, Alpha, Beta und Gamma) durch heterologe Impfung mit S-Trimer-Impfstoff (D614 auf D0 und Beta auf D21) induziert wurden -Dosen mit einem bivalenten Impfstoff41. Die begrenzte Breite der Reaktionen, die in unserer Studie mit dem heterologen D614/Beta-Regime beobachtet wurde, steht im Gegensatz zu der erweiterten Breite neutralisierender Reaktionen, die kürzlich nach einer späten Auffrischungsimpfung bei NHPs und Menschen beobachtet wurden14,15,16. Dies hängt wahrscheinlich mit der fehlenden Reifung der Gedächtnis-B-Zellpopulation zusammen, wenn die zweite Injektion kurz nach der Grundimmunisierung durchgeführt wird (hier 3 Wochen im Vergleich zu 6 Monaten bis 1 Jahr im Zusammenhang mit einer Auffrischungsimpfung)42,43. Während im heterologen D614-Prime/Bivalent-Boost-Regime das beobachtete D614-Ab-Profil der „ursprünglichen antigenen Sünde“ entspricht, bei der die erste Exposition die durch Auffrischungsimpfungen hervorgerufenen Ab-Reaktionen bestimmt44,45, ist im Zusammenhang mit der COVID-Auffrischungsimpfung das Durch die Primärimmunisierung werden Keimzentren effizient aktiviert, die dann mit der Zeit breitere Ab-Reaktionen erzeugen46.

Die Studie zeigte eine Stabilität der neutralisierenden Titer zwischen 3 und 12 Monaten mit den verschiedenen CoV2 preS dTM-AS03-Impfstoffformulierungen nach einer Grundimmunisierungsserie mit zwei Dosen. Dies steht im Gegensatz zu dem kontinuierlichen Rückgang der nAb, der mit dem mRNA-1273-Impfstoff über einen ähnlichen Zeitraum (bis D209) beim Menschen beobachtet wurde47.

Unseres Wissens sind dies die ersten Daten, die eine umfassende Kreuzneutralisierung belegen, die alle neu auftretenden VOC bis zu 12 Monate in NHPs nach einer Grundimmunisierung mit zwei Dosen abdeckt. Frühere Studien zeigten, dass bivalente oder nanopartikelbasierte Impfstoffkandidaten in der Lage waren, ausgewogene neutralisierende Ab-Reaktionen gegen VOC auszulösen, die Daten waren jedoch auf Mäuse beschränkt oder anhand einer begrenzteren Anzahl von Varianten dokumentiert41,48,49,50. Andere Kandidaten, die auf Spike-Ferritin-Nanopartikeln oder RBD-Ferritin-Nanopartikeln basierten, zeigten eine ähnliche Breite gegen SARS-CoV-1 und eine ähnliche Ab-Haltbarkeit; Allerdings befinden sich diese Kandidaten in einem früheren klinischen Entwicklungsstadium51,52,53. Zukünftige Studien zu langlebigen Plasmazellen und Gedächtnis-B-Zellkompartimenten wären erforderlich, um die Dauerhaftigkeit der Ab-Reaktionen bei mRNA- und proteinbasierten Impfstoffen besser zu verstehen.

In dieser Studie haben wir auch die Wirksamkeit des Impfstoffs bei Hamstern gezeigt, bei denen die Beta-haltige bivalente Impfstoffformulierung nach einer Belastung mit den Varianten D614G, Alpha und Beta vor Lungenpathologie und Virusreplikation schützte. Der Schutz vor Infektionen und Pathologien wurde bei Tieren mit verringerten kreuzneutralisierenden Antikörpertitern beobachtet, die durch die Immunisierung mit den monovalenten Formulierungen hervorgerufen wurden, was das Fehlen einer verstärkten Krankheit im Zusammenhang mit heterologen Infektionen unterstützt. Bemerkenswert ist, dass zwei Hamster in der monovalenten D614-Impfstoffgruppe zwei Wochen nach der zweiten Dosis niedrige Antikörperbindungstiter (ELISA) und keine nachweisbaren neutralisierenden Antikörpertiter zeigten. Diese Beobachtungen korrelierten mit klinischen Anzeichen einer Infektion nach der Belastung (Gewichtsverlust, Virusreplikation und Lungenpathologie). Eine explorative Analyse ergab, dass der Schutz vor Pathologien mit nachweisbaren neutralisierenden Antikörpertitern verbunden war; Es konnte jedoch kein Schwellenwert identifiziert werden. Zukünftige Studien wären erforderlich, um Schutzschwellen für Varianten zu definieren54,55 und die Rolle der durch den Impfstoff ausgelösten kreuzreaktiven T-Zell-Reaktionen beim Impfstoffschutz zu untersuchen56.

Obwohl die hier vorgestellten Studien eine geringe Anzahl von Tieren pro Gruppe umfassten und den Schutz kurz nach der Immunisierung bewerteten, wurden die Ergebnisse kürzlich in einer großen klinischen Wirksamkeitsstudie (NCT04904549) bestätigt, in der nach der Primärimmunisierung ein hohes Maß an Schutz gegen symptomatische Omicron-Infektionen nachgewiesen wurde der Beta-haltige bivalente CoV2 preS dTM-AS03-Impfstoff57. Interessanterweise zeigte der monovalente Beta-CoV2-preS-dTM-AS03-Impfstoff in zwei weiteren klinischen Phase-3-Studien (NCT04762680, NCT05124171) eine signifikante Überlegenheit gegenüber dem D614-basierten Impfstoff bei der Steigerung der Omicron-nAbs bei Erwachsenen, die zuvor mit mRNA-COVID-19-Impfstoffen geimpft wurden16,17 .

Angesichts der kontinuierlichen schnellen Virusentwicklung, bei der Immun-Escape-Varianten selektiert werden, könnten sowohl die naive Bevölkerung, wie etwa junge oder noch nicht geimpfte, als auch die zuvor geimpfte Bevölkerung von den breiten und dauerhaften Immunantworten profitieren, die durch das Beta-haltige CoV2 preS verliehen werden dTM-AS03-Impfstoffformulierungen.

Proteinsequenzen sind auf GISAID unter Verwendung der im Manuskript angegebenen Zugangscodes verfügbar: B.1.351 Sequenzen GISAID Zugang EPI_ISL_1048524. Die in dieser Studie generierten Quelldaten werden als Zusatzdaten 1 bereitgestellt. Alle anderen Daten waren auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor (oder ggf. anderen Quellen) erhältlich.

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Mitglieder des Histopathologie- und IHC-Teams von Sanofi Global Discovery Pathology (TIM) für ihre hervorragende technische Hilfe bei Histologie- und IHC-Verfahren an Hamsterlungenproben. Die Autoren danken Jon Smith für die Koordination der Produktion und Bereitstellung der Impfstoffantigene für die Studie, Caroline Patriarca- Ruat für das Projektmanagement und Carlos Diaz-Granados, Stephen Savarino und Saranya Sridhar für kritische Diskussionen zu den Studiendesigns und der Datenanalyse. Die Autoren danken Dean Huang für das Testen von Hamsterseren im ELISA und Julie Piolat für die Unterstützung bei statistischen Analysen. Die Autoren danken außerdem Isabel Grégoire, Hardik Ashar, Priya Upadhyay und Hanson Geevarghese (Sanofi) für die redaktionelle Unterstützung und die Koordinierung des Papiers. Diese Arbeit wurde in Zusammenarbeit mit GSK durchgeführt, das den Zugang zum AS03-Adjuvanssystem und dessen Nutzung ermöglichte. Die Finanzierung erfolgte zum Teil durch Sanofi und durch die Biomedical Advanced Research and Development Authority (BARDA), Administration for Strategic Preparedness and Response beim US-Gesundheitsministerium, im Rahmen des Vertrags Nr. HHSO100201600005I und in Zusammenarbeit mit dem US-Verteidigungsministerium Gemeinsames Programm-Exekutivbüro für chemische, biologische, radiologische und nukleare Verteidigung gemäß Vertrag Nr. W15QKN-16-9-1002.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Catherine Berry, Vincent Pavot.

Sanofi, Impfstoffforschung und -entwicklung, Marcy l'Etoile, Frankreich

Catherine Berry, Vincent Pavot, Alice Raillard, Sylviane Gautheron und Valerie Lecouturier

Sanofi, Impfstoffforschung und -entwicklung, Cambridge, MA, USA

Natalie G. Anosova, Michael Kishko, Lu Li, Tim Tibbitts und Roman M. Chicz

Sanofi, Framingham, MA, USA

Sheila Cummings und Dinesh S. Bangari

BIOQUAL Inc, Rockville, MD, USA

Swagata Kar

Ragon Institute of MGH, MIT und Harvard, Cambridge, MA, USA

Caroline Atyeo, Yixiang Deng & Galit Alter

GSK, Rixensart, Belgien

Cindy Gutzeit

GSK, Wavre, Belgien

Marguerite Koutsoukos

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VL, TT, CB, VP, AR, SG, NGA, RMC, CG, M.Ko, CA und GA haben zum Konzept oder Design der Studie beigetragen. MK, SG, AR, SG, DSB, SK und CA trugen zur Durchführung der Studie und Probenanalyse bei. VL, TT, CB, VP, AR, SG, NGA, RMC, CG, MK, CA, GA, CG und M.Ko waren an der Interpretation der Daten und der Überprüfung des Manuskripts beteiligt. VL, VP und CB verfassten das erste Manuskript.

Korrespondenz mit Valerie Lecouturier.

CB, VP, NGA, MK, DH, TT, AR, SG, DSB, RMC und VL sind Mitarbeiter des Sanofi-Unternehmens und dürfen Anteile halten. SC war zum Zeitpunkt der Studiendurchführung ein Mitarbeiter von Sanofi und ist derzeit bei AbbVie beschäftigt und hält Anteile an Sanofi. SK ist Mitarbeiter von Bioqual und meldet keine Konflikte. GA ist Mitbegründer und Berater von SeromYx Systems Inc. und verfügt über ein über SeromYx Systems Inc. angemeldetes Patent. CA und GA waren zum Zeitpunkt der Studiendurchführung Mitarbeiter des Ragon Institute of MGH, MIT und Harvard und sind derzeit bei Moderna beschäftigt. YD hat nichts zu verraten. M.Ko und CG sind Mitarbeiter der GSK-Unternehmensgruppe und melden den Besitz von GSK-Aktien.

Communications Medicine dankt Teresa Aydillo-Gomez und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Berry, C., Pavot, V., Anosova, NG et al. Beta-haltiger bivalenter SARS-CoV-2-Proteinimpfstoff löst bei Makaken eine dauerhafte, breite Neutralisierung und bei Hamstern Schutz aus. Commun Med 3, 75 (2023). https://doi.org/10.1038/s43856-023-00302-z

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Eingegangen: 19. August 2022

Angenommen: 09. Mai 2023

Veröffentlicht: 26. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43856-023-00302-z

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