Lysosomal

Apr 13, 2023

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2654 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Aufgrund ihrer hohen Inzidenz hat die nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) große Aufmerksamkeit erhalten. Hier zeigen wir durch umfangreiche bioinformatische Analysen, dass das Lysosomal-assoziierte Protein Transmembran 5 (LAPTM5) mit der NASH-Progression assoziiert ist. Der Proteingehalt von LAPTM5 korreliert negativ mit dem NAS-Score. Darüber hinaus wird der Abbau von LAPTM5 durch seine Ubiquitinierungsmodifikation durch die E3-Ubquitin-Ligase NEDD4L vermittelt. Durch Experimente an männlichen Mäusen wurde entdeckt, dass die Hepatozyten-spezifische Depletion von Laptm5 die NASH-Symptome bei Mäusen verschlimmert. Im Gegensatz dazu hat die Überexpression von Laptm5 in Hepatozyten diametral entgegengesetzte Wirkungen. Mechanistisch interagiert LAPTM5 mit CDC42 und fördert dessen Abbau auf lysosomenabhängige Weise unter der Stimulation von Palmitinsäure, wodurch die Aktivierung des Mitogen-aktivierten Proteinkinase-Signalwegs gehemmt wird. Schließlich lindert die Adenovirus-vermittelte Überexpression von Laptm5 in der Leber die oben genannten Symptome in NASH-Modellen.

Die nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) ist pathologisch durch Lebersteatose, Hepatozyten-Ballonbildung, lobuläre und hepatische Entzündung sowie interstitielle Fibrose gekennzeichnet1,2. Als Hauptursache für das Fortschreiten von Leberzirrhose und hepatozellulärem Karzinom (HCC) ist NASH für jeden fünften Menschen mit nichtalkoholischer Fettlebererkrankung (NAFLD) verantwortlich und betrifft aktuellen Schätzungen zufolge etwa 25 % der erwachsenen Weltbevölkerung Berichte3,4. Leider sind wirksame therapeutische Maßnahmen zum Schutz vor der Entwicklung und dem Fortschreiten von NASH nach wie vor begrenzt, und bisher stand keine von der FDA zugelassene pharmakologische Therapie zur Verfügung5,6. Die molekularen Ziele von NASH haben aufgrund ihrer guten Aussicht auf therapeutische Anwendung zunehmende Aufmerksamkeit erregt7.

In den letzten Jahren war die Rolle der Lysosomen-bezogenen Regulation beim Krankheitsverlauf Gegenstand aktiver Studien. Tatsächlich funktionieren Lysosomen Berichten zufolge nicht nur beim Abbau und Recycling von Zellabfällen, sondern sind auch wichtige Organellen, die am Proteinabbau, der Nährstoffwahrnehmung sowie der angeborenen und adaptiven Immunität beteiligt sind8,9. Und bisher wurde nachgewiesen, dass Lysosomen mit mehreren Signalwegen interagieren und das Fortschreiten einer Reihe von Krankheiten regulieren, wie etwa Arteriosklerose, neurodegenerative Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und lysosomale Speicherstörungen. Mittlerweile geht man davon aus, dass der durch das Proteostasesystem modulierte Proteinabbau eine attraktive Plattform für die gezielte Wirkstoffgewinnung darstellt und eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl menschlicher physiologischer Aktivitäten spielt10,11.

Die LAPTM-Familie, bestehend aus LAPTM4A, LAPTM4B und LAPTM5, wurde in den letzten Jahren aufgrund ihrer Rolle beim Proteintransport und Lysosomenabbau intensiv untersucht und kann als besonderes Ziel für die Intervention bei Krankheiten dienen. Lysosomal-assoziiertes Protein Transmembran 5 (LAPTM5) gehört zur Familie der späten endosomalen/lysosomalen Transmembranproteine12 und wurde ursprünglich als Regulator der Proteinhomöostase13,14 und Modulator entzündlicher Signalwege15 identifiziert. LAPTM5 verbessert die Herzhypertrophie durch Modulation der Aktivität des MAPK-Signalwegs16. Unsere früheren Untersuchungen17,18 und Studien anderer Forscher19,20 zeigten, dass die Aktivierung des MAPK-Signalwegs eng mit der Entwicklung und dem Fortschreiten von NASH zusammenhängt. Basierend auf einigen vorläufigen Erkenntnissen wurde diese Studie auf der Hypothese durchgeführt, dass LAPTM5 an der NASH-Progression beteiligt ist.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die Proteinexpression von LAPTM5 in der Leber sowohl von menschlichen NASH-Probanden als auch von Maus-NASH-Modellen signifikant herunterreguliert war. Die Abreicherung von LAPTM5 in Hepatozyten verschlimmerte die Lebersteatose, Entzündung und Fibrose in Maus-NASH-Modellen, die durch eine fett- und cholesterinreiche (HFHC)-Diät induzierten wurden, erheblich, wohingegen die Überexpression von LAPTM5 in Hepatozyten die oben genannten pathologischen Veränderungen erheblich verzögerte und abschwächte. Wir fanden außerdem heraus, dass LAPTM5 direkt mit dem Protein Cell Division Cycle 42 (CDC42) interagieren kann und eine Überexpression von LAPTM5 dessen lysosomalen Abbau unter Palmitinsäurestimulation fördert. Andererseits wurde die Expression von CDC42 deutlich erhöht, wenn die LAPTM5-Expression verringert wurde, was sowohl in murinen als auch in menschlichen NASH-Geweben bestätigt wurde. Infolgedessen könnte die schützende Wirkung von LAPTM5 auf die Lipidablagerung und den Metabolismus in Hepatozyten sowie die Aktivierungshemmung des MAPK-Signalwegs durch die Überexpression von CDC42 deutlich aufgehoben werden. Darüber hinaus wurde die Hepatozyten-Lipidablagerung aufgrund des Knockouts von LAPTM5 durch den CDC42-Knockdown deutlich unterdrückt, was darauf hindeutet, dass LAPTM5 die NASH-Progression reguliert, indem es die Proteinexpression von CDC42 moduliert, um die Aktivität des MAPK-Signalwegs zu vermitteln. Auch eine Adenovirus-vermittelte Therapie könnte die NASH-Symptome erheblich lindern. Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass LAPTM5 mechanistisch als Regulator der NASH-Progression fungiert und klinisch auch als Indikator für die NASH-Progression und als Ziel für die Behandlung von NASH dienen könnte.

Während NASH pathophysiologisch kompliziert und multifaktoriell ist, wurde festgestellt, dass eine große Anzahl von Proteinen an der Regulierung von NASH beteiligt ist. Um herauszufinden, welche Proteine ​​die kritischsten Determinanten bei der Pathogenese von NASH sind, haben wir 10 klinische RNA-Seq-Datenbanken aus Leberproben von NASH-Probanden durchsucht und drei konservierte Proteine ​​gefunden, die in Lysosomen, bestimmten Granula und azurophilen Granulatlumen vorhanden sind und darin enthalten sind in allen 10 klinischen Datenbanken (Abb. 1a – c). Bemerkenswert ist, dass die Schwere der Erkrankung am engsten mit der Expression von im Lysosom lokalisierten Proteinen korreliert (Abb. 1d). Die Suchergebnisse in 5 Datenbanken mit RNA-Seq aus Mauslebern bestätigten diese Schlussfolgerung ebenfalls (Abb. 1e). Angesichts der wichtigen Rolle von Transmembranproteinen beim Fortschreiten der Krankheit21,22,23 wurden 71 Transmembranproteine ​​unter den oben genannten lysosomal assoziierten Proteinen identifiziert. Eine High-Content-Screening-Analyse wurde durchgeführt, um die Wirkung dieser Gene auf Lipidprofile zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass LAPTM5 die stärkste hemmende Wirkung auf die Hepatozyten-Lipidakkumulation bei PA-Stimulation hatte (Abb. 1f). Um die Korrelation zwischen LAPTM5 und NASH zu untersuchen, haben wir zunächst die Proteinexpression von LAPTM5 in der Leber von Menschen ohne Steatose oder mit NASH bestimmt. Es wurde festgestellt, dass die LAPTM5-Proteinspiegel in der Leber bei NASH-Patienten deutlich herunterreguliert waren als bei Patienten ohne Steatose -NASH-Gegenstücke (Abb. 1g und ergänzende Abb. 1a, b). In Kombination mit den Ergebnissen der Immunhistochemie stellten wir fest, dass die Proteinspiegel von LAPTM5 negativ mit dem NAS-Score korrelierten (Abb. 1h, i). In Übereinstimmung mit unserer Beobachtung beim Menschen war die LAPTM5-Proteinexpression in der Leber von ob/ob-Mäusen und Wildtyp-Mäusen, die eine fettreiche Diät (HFD), eine fettreiche, cholesterinreiche Diät (HFHC) oder Methionin erhielten, signifikant verringert Cholinmangeldiät (MCD) (Abb. 1j und ergänzende Abb. 1c – e). Darüber hinaus zeigten In-vitro-Experimente, dass die LAPTM5-Proteinexpression zeitabhängig sowohl in menschlichen L02-Hepatozyten als auch in primären Maus-Hepatozyten nach PA-Behandlung dramatisch abnahm (ergänzende Abbildung 1f, g). Anschließend wurde die Genexpression von Laptm5 in NASH oder Nicht-NASH durch qPCR nachgewiesen und das Ergebnis zeigte unerwartet, dass die mRNA-Spiegel von Laptm5 sowohl in In-vivo- als auch in In-vitro-Modellen vergleichbar waren, was darauf hindeutet, dass LAPTM5 posttranskriptionell reguliert wurde Reaktion auf Stoffwechselstimulation (Ergänzende Abbildung 1h-j). Insgesamt lässt die auffallend negative Korrelation zwischen der LAPTM5-Expression und der NASH-Entwicklung darauf schließen, dass LAPTM5 eine Rolle beim verzögerten Fortschreiten der Erkrankung spielt.

a Die GSE stammt aus der RNA-Sequenz menschlicher Lebern klinischer NASH-Patienten und gesunder oder gesunder Adipositaspatienten. Genkategorien, die zwischen ≥10 GSE-Daten geteilt werden, werden durch schwarze Punkte angezeigt. Das Histogramm über jedem Diagramm zeigt die Zeiten der aktivierten Genkategorien in jeder Kategorie an. b Das Kreisdiagramm zeigte die statistische Darstellung der gemeinsamen GSE-Genkategorien. Die ganzen Zahlen in Klammern stellen Genkategorien dar und die Klammern außerhalb stehen für die Anzahl der geteilten GSE. c NES-Punktdiagramm der Kategorie 3 konservierter Gene in 10 menschlichen Datenbanken. d GSVA-Score-Analyse dieser 3 konservierten Gene in den Datenbanken. e NES-Analyse von 5 Datenbanken aus Mauslebern. f Quantitative Analyse der Nilrot-Fluoreszenzintensität von L02-Zellen mit 71 molekularer Überexpression (n = 3 unabhängige Experimente). g Repräsentative Western-Blot-Analyse (links) und Quantifizierung (rechts) der LAPTM5-Proteinspiegel in den menschlichen Lebern von NASH- (n = 20 Personen) oder Nicht-NASH-Gruppen (n = 16 Personen). h Immunhistochemische Färbung von LAPTM5 in Leberschnitten von Menschen in den angegebenen Gruppen (n = 5 Personen/Gruppe). Maßstabsbalken, 50 μm. i Korrelationsanalyse zwischen LAPTM5-Proteinspiegeln (normalisiert auf β-Actin-Spiegel) und NAS (r2 = 0,6964, p < 0,0001), (n = 36 Personen). j Repräsentative LAPTM5-Proteinspiegel in den Lebern von Mäusen, die mit normaler Chow-Diät und mit HFHC-Diät gefüttert wurden (n = 6 Mäuse/Gruppe). Für (d) werden die Daten als Whisker-Plots dargestellt: Mittellinie, Median; Kasten, 25.–75. Perzentil; Whisker, minimale bis maximale Werte; Für f, g, j werden die Daten als Mittelwert ± SD dargestellt und für die statistische Analyse wurde ein zweiseitiger Student-t-Test verwendet. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um den Mechanismus, der der Herunterregulierung des LAPTM5-Proteins in NASH zugrunde liegt, weiter zu untersuchen. Es wurde berichtet, dass intrazelluläre Proteine ​​über das Ubiquitin-Proteasom-System oder den Autophagieweg abgebaut werden könnten24, Inhibitoren der verschiedenen Wege wurden in mit Palmitinsäure (PA) stimulierten Hepatozyten behandelt und der Proteinabbau von LAPTM5 wurde durch den Proteasom-Inhibitor MG132 gerettet , während der Lysosomen-Inhibitor Chlq bei der Rettung keine Rolle spielte. (Abb. 2a, b). Anschließend wurden die Proteine, die am Abbau von LAPTM5 beteiligt sein könnten, IP-massenspektrometrisch nachgewiesen und es wurde festgestellt, dass NEDD4L, NEDD4, WWP2 und ITCH den Anforderungen entsprechen (Abb. 2c). Das Ergebnis der Massenspektrometrie wurde durch einen CO-IP-Test verifiziert und NEDD4L zeigte die stärkste Wechselwirkung mit LAPTM5 (Abb. 2d). Unterdessen hatte die Überexpression von NEDD4L den stärksten fördernden Effekt auf den Abbau von LAPTM5 (Abb. 2e), was darauf hindeutet, dass NEDD4L ein wichtiger Regulator beim Abbau von LAPTM5-Proteinen ist. Anschließend wurde die Wechselwirkung zwischen LAPTM5 und NEDD4L in vitro durch CO-IP- und GST-Präzipitationstests weiter bestätigt (Abb. 2f, g). Um den Mechanismus der NEDD4L-Vermittlung des LAPTM5-Abbaus besser zu verstehen, wurden IP-Assays durchgeführt, um die Ubiquitinierung von LAPTM5 zu untersuchen. Während die Ubiquitinierung von LAPTM5 bei Überexpression von NEDD4L deutlich verstärkt wurde, wurde diese Modifikation nach der Inaktivierung von NEDD4L blockiert (Abb. 2h, i). Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Abbau von LAPTM5 durch NEDD4L durch K48-verknüpfte Ubiquitinierung vermittelt wurde (Abb. 2j, k). Darüber hinaus haben wir nachgewiesen, dass der Abbau durch die E3-Ligase von NEDD4L gefördert wird (Abb. 2l). Darüber hinaus konnte durch den Abbau von NEDD4L der Abbau von LAPTM5 erfolgreich gerettet werden (Abb. 2m). Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Proteinspiegel von NEDD4L in der NASH-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant hochreguliert waren, was sowohl bei menschlichen NASH-Probanden als auch bei Maus-NASH-Modellen und mit PA stimulierten Hepatozyten bestätigt wurde (ergänzende Abbildung 2a – e). . Die Ergebnisse zeigten, dass NEDD4L auch von NASH reguliert wurde.

a und b Western-Blot-Bilder der LAPTM5-Proteinspiegel in Maus-Hepatozyten (a) und L02-Hepatozyten (b), behandelt mit MG132 (50 μM), Chlq (50 μM) oder DMSO. c Verfahren zur Identifizierung der E3-Ubiquitin-Ligasen, die mit LAPTM5 interagieren, durch Analyse von IP-MS. d Interaktion zwischen LAPTM5 und NEDD4L, NEDD4, ITCH, WWP2 in L02-Zellen. Der Western Blot zeigt die Expression von LAPTM5 nach Transfektion mit den angegebenen Plasmiden. f und g Co-IP (f) und GST-Pulldown (g) zeigen die Interaktion zwischen LAPTM5 und NEDD4L. h Co-IP-Ergebnisse zeigen die Wirkung von NEDD4L auf die Ubiquitinierung von LAPTM5 nach MG132-Behandlung (25 μM). i Co-IP-Assays der Ubiquitinierung von LAPTM5 nach verschiedenen Behandlungen. j Ubiquitinierungsscreening von LAPTM5 durch NEDD4L mit den angegebenen Ubiquitintypen. (k) Ubiquitinierung von LAPTM5 in L02-Hepatozyten, die mit den angegebenen Plasmiden transfiziert wurden. l LAPTM5-Proteinspiegel in L02-Zellen, die mit den angegebenen Plasmiden transfiziert wurden. m Western-Blot-Ergebnisse der LAPTM5-Expressionsänderungen nach dem Abbau von NEDD4L in primären Hepatozyten. Immunoblots sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Wirkung von LAPTM5 auf den Lipidstoffwechsel und die Entzündung in Hepatozyten zu untersuchen, isolierten wir primäre Hepatozyten aus Laptm5-Knockout-Mäusen (Laptm5-KO) und Laptm5-Flox-Kontrollmäusen, wobei primäre Hepatozyten mit einem Adenovirus-Vektor-vermittelten Plasmid infiziert waren, das Laptm5 überexprimierte (AdLaptm5). -Flag) (Abb. 3a und ergänzende Abb. 3a). Die Nilrot-Färbung (Abb. 3b und ergänzende Abb. 3b) ergab, dass sich die PAOA-induzierte Hepatozyten-Lipidakkumulation in der Laptm5-KO-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich verschlechterte und mit erhöhten Konzentrationen an Triglycerid (TG) und Gesamtcholesterin (TC) einherging. (Abb. 3b, c). Im Gegensatz dazu verbesserte die Überexpression von Laptm5 in Hepatozyten die PAOA-induzierte Lipidablagerung (ergänzende Abbildung 3b, c). Und es wurde kein signifikanter Unterschied in der Lipidablagerung in den Hepatozyten in den mit BSA behandelten Gruppen beobachtet. Darüber hinaus wurden die hemmenden Wirkungen von LAPTM5 auf den Lipidstoffwechsel und die Entzündung durch qPCR und Western Blot weiter bestätigt (Abb. 3d – g und ergänzende Abb. 3d – g). Darüber hinaus kategorisierte die hierarchische Clusteranalyse auf der Grundlage unserer RNA-seq-Daten die mit PAOA behandelten Proben eindeutig in zwei Untergruppen: Laptm5-Flox-PAOA und Laptm5-KO-PAOA (Abb. 3h). Es ist erwähnenswert, dass Laptm5-Knockout die biologischen Prozesse induziert, die mit dem Lipidstoffwechsel und der Entzündung zusammenhängen (Abb. 3i – k). Insgesamt deuten diese In-vitro-Beweise darauf hin, dass LAPTM5 eine schützende Wirkung auf die durch metabolischen Stress verursachte Lipidansammlung und Entzündung in Hepatozyten ausübt.

a LAPTM5-Proteinspiegel in Hepatozyten, die aus Laptm5-Knockout-Mäusen (KO) oder WT-Mäusen isoliert wurden (n = 3 Mäuse/Gruppe). b und c Nilrot-Färbung (b) und TG-, TC-Gehalte (c) in primären Hepatozyten nach den angegebenen Stimulationen. Maßstabsbalken, 25 μm, (n = 3 unabhängige Experimente). d und e Relative mRNA- (n = 4 Mäuse/Gruppe) (d) und Protein- (n = 3 Mäuse/Gruppe) (e) Konzentrationen von Markern im Zusammenhang mit dem Fettsäurestoffwechsel in den angegebenen Gruppen. f und g Relative mRNA- (n = 4 Mäuse/Gruppe) (f) und Protein- (n = 3 Mäuse/Gruppe) (g) Konzentrationen von Markern im Zusammenhang mit Entzündungen in den angegebenen Gruppen. Die Proteinexpression wurde auf β-ACTIN normalisiert. h Hierarchische Clusteranalyse der RNA-seq-Daten der PAOA-stimulierten primären Hepatozyten, die aus WT- und Laptm5-KO-Mäusen isoliert wurden. (ik) GSEA-Signalweganreicherungsanalyse und Heatmaps zeigen die Aktivierung von Signalwegen und die Genexpression des Lipidstoffwechsels und der Entzündung. PAOA, 0,5 mM/1,0 mM; PA, 0,5 mM, OA, 1,0 mM. Für alle statistischen Analysen werden die Ergebnisse als Mittelwert ± SD dargestellt. Einfaktorielle ANOVA des Bonferroni-Post-hoc-Tests (c, d – Scd1, d – Srebf1 und f – Tnf) und des Tamhane T2-Post-hoc-Tests (b, d – Fasn, b – Pparg, f – Ccl2 und f). —Cxcl10) wurde zur Bewertung der Unterschiede verwendet. Zur Bewertung der Unterschiede in (g) wurde der zweiseitige Student-t-Test verwendet. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um den Einfluss von LAPTM5 auf Steatohepatitis und ihre Komplikationen weiter zu untersuchen, konstruierten wir Hepatozyten-spezifische Laptm5-Knockout-Mäuse (Laptm5-HKO) (ergänzende Abbildungen 4a, b und Abbildung 4a) und zogen sie mit normaler Chow- (NC) oder HFD-Diät auf für 24 Wochen. Laptm5-HKO-Mäuse zeigten bei normaler Ernährung im Vergleich zu Laptm5-Flox-Mäusen keinen Unterschied im Körpergewicht, Lebergewicht oder Lipidprofil. Dennoch zeigten Laptm5-HKO-Mäuse nach 24-wöchiger HFD-Diät ein höheres Lebergewicht, Körpergewicht, Nüchternblutzucker und TG/TC-Werte in Leber und Serum als die Kontrollgruppe (Abb. 4b – h). Darüber hinaus waren diese Maßnahmen bei Laptm5-HKO-Mäusen im Vergleich zu Laptm5-Flox-Mäusen noch verstärkt. Darüber hinaus wurden auch bei den mit HFD gefütterten Laptm5-HKO-Mäusen eine größere Leber und eine starke Lipidansammlung beobachtet (Abb. 4i, j), mit einer Expression von Genen im Zusammenhang mit der Lipidaufnahme (Cd36) und -synthese (Fasn, Scd1, Pparg und). Srebf1) wird hochreguliert (Abb. 4k – m). Darüber hinaus erlitten die Lebern der Laptm5-HKO-Mäuse aufgrund der HFD-Diät eine schwerwiegendere Schädigung, was durch höhere Alanin-Aminotransferase- (ALT) und Aspartat-Aminotransferase- (AST) Werte im Vergleich zu den Kontrollen belegt wurde (Abb. 4n, o). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Deletion von Laptm5 das Fortschreiten der NAFLD weiter vorantrieb.

a LAPTM5-Proteinspiegel im Lebergewebe von Laptm5-HKO- und Laptm5-Flox-Mäusen (n = 3 Mäuse/Gruppe). b Körpergewicht von Laptm5-HKO- und Laptm5-Flox-Mäusen nach NC- oder HFD-Verzehr über 24 Wochen. c–e Nüchternblutzucker (c), Lebergewicht (d) und Verhältnisse von Lebergewicht zu Körpergewicht (LW/BW) (e) von Laptm5-HKO- und Laptm5-Flox-Mäusen nach NC- oder HFD-Verzehr über 24 Wochen. f–h Hepatischer TG- (f), TC- (g) und Serum-TC-Gehalt (h) von Mäusen in den angegebenen Gruppen. i Makroskopische und histologische Bilder von Leber (links, Maßstabsbalken, 1 cm), H&E (Mitte) und Oil Red O (rechts) (Maßstabsbalken, 100 μm) Färbung der Leberschnitte von Mäusen in den angegebenen Gruppen (n = 6 Mäuse/Gruppe). j NAS-Score-Analyse (links) und statistische Analyse der Ölrot-O-Färbung (rechts), (n = 6 Mäuse/Gruppe). k und l Relative mRNA- (n = 4 Mäuse/Gruppe) (k) und Protein- (n = 3 Mäuse/Gruppe) (l) Konzentrationen relevanter Marker in den Lebern der angegebenen Gruppen. m Immunhistochemische Färbung von PPARγ in Leberschnitten von Mäusen in den angegebenen Gruppen (n = 6 Mäuse/Gruppe). Maßstabsbalken, 50 μm. n und o Serum-ALT- und AST-Konzentrationen bei Mäusen in den angegebenen Gruppen. Für b–h und n, o, n = 10 Mäuse pro NC-Gruppe, n = 11 Laptm5-Flox-Mäuse und n = 10 Laptm5-HKO-Mäuse für die HFD-Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± SD, ns, nicht signifikant dargestellt. Durch einfaktorielle ANOVA mit Tamhane-T2-Post-hoc-Test für (b–d, f–h, k-Scd1, k-Pparg und k-Srebf1 sowie n und o) und Bonferronis Post-hoc-Analyse für (e, k -Cd36 und k-Fasn).Der nichtparametrische statistische Mann-Whitney-U-Test in (j – links) und der zweiseitige Student-t-Test in (j – rechts). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Da NASH das fortgeschrittene Stadium von NAFLD darstellt, haben wir Laptm5-Flox- und Laptm5-HKO-Mäuse 16 Wochen lang mit einer HFHC-Diät gefüttert, um die Rolle von LAPTM5 in einem Maus-NASH-Modell weiter zu untersuchen. Obwohl beim Körpergewicht kein Unterschied festgestellt wurde, verschlechterten sich die Indikatoren für den Lipidstoffwechsel, wie Lebergewicht und Nüchternblutzucker, sowie die Lipidablagerung in der HKO-Gruppe 8 Wochen nach der HFHC-Fütterung, und diese Indikatoren verschlimmerten sich nach 16 Wochen der HFHC-Fütterung noch weiter im Vergleich zur Flox-Gruppe (Abb. 5a – f und ergänzende Abb. 5a – d). Gleichzeitig verschlechterten sich auch die entzündliche Infiltration und die Leberfibrose bei längerer HFHC-Fütterung (Abb. 5g – i und ergänzende Abb. 5e – i). In Übereinstimmung mit den vorstehenden Erkenntnissen verstärkte ein Laptm5-Mangel in der Leber die Serumspiegel von ALT und AST (Abb. 5j). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass ein Laptm5-Mangel die Steatohepatitis und ihre metabolischen Komplikationen deutlich verschlimmerte. Anschließend extrahierten wir die mRNA aus Lebergewebe von HFHC-induzierten Laptm5-HKO- und Flox-Mäusen zur Sequenzierung und untersuchten systematisch das Genexpressionsprofil in den beiden Gruppen nach der Laptm5-Deletion in NASH. Wir fanden heraus, dass bei NASH ein Laptm5-Mangel in der Leber die Hochregulierung einer Vielzahl von Signalwegen und Genen verursachte, die den Fettstoffwechsel, Entzündungen und Fibrose fördern (Abb. 5k – n).

a Nüchternblutzucker von Laptm5-HKO- und Laptm5-Flox-Mäusen für NC- oder HFHC-Konsum (n = 10 Mäuse/Gruppe). b und c Lebergewicht und LW/BW (b) sowie hepatischer TG- und TC-Gehalt (c) von Laptm5-HKO- und Laptm5-Flox-Mäusen nach NC- oder HFHC-Fütterung für 8 oder 16 Wochen (n = 10 Mäuse/Gruppe). d H&E- (oben) und Oil Red O-Färbung (unten) in den Leberschnitten von Mäusen in den angegebenen Gruppen (n = 6 Mäuse/Gruppe). Maßstabsbalken, 100 μm. e und f NAS-Score-Analyse (e) und die statistische Analyse der Ölrot-O-Färbung (f) von Laptm5-HKO- und Laptm5-Flox-Mäusen nach NC- oder HFHC-Fütterung für 8 oder 16 Wochen (n = 6 Mäuse/Gruppe). g Immunfluoreszenzfärbung (g) und statistische Analyse (h, i) von CD11b (rot) in den Leberschnitten von Mäusen in den angegebenen Gruppen. (Kerne, blau) (n = 4 Mäuse/Gruppe). Maßstabsbalken, 50 μm. PSR-Färbung von Mäuseleberschnitten in den angegebenen Gruppen. (8 Wochen, n = 6 Mäuse/Gruppe, 16 Wochen, n = 7 Laptm5-Flox-Mäuse und n = 5 Laptm5-HKO-Mäuse). Maßstabsbalken, 100 μm. j Serum-ALT- und AST-Konzentrationen von Mäusen in den angegebenen Gruppen (n = 10 Mäuse/Gruppe). k Hierarchische Clusteranalyse der RNA-seq-Daten der Mäuse, denen die HFHC-Diät verabreicht wurde. l und m GSEA-Signalweganreicherungsanalyse von Signalwegen im Zusammenhang mit Lipidstoffwechsel, Entzündung, Apoptose und Fibrose. n Heatmaps der Gene im Zusammenhang mit Lipidstoffwechsel, Entzündungsreaktionen und Fibrose (rot, hochreguliert; blau, herunterreguliert) in den angegebenen Gruppen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Der nichtparametrische statistische Mann-Whitney-U-Test wurde für die statistische Analyse in (c-8w, e-16w und i-16w) und der zweiseitige Student-t-Test in anderen Panels verwendet. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Unter Berücksichtigung der Heterogenität von NASH untersuchten wir dann die Rolle von LAPTM5 in einem durch Methionin- und Cholinmangeldiät (MCD) induzierten Maus-NASH-Modell und stellten fest, dass entzündliche Infiltration und Leberschäden wesentlich schwerwiegender waren25. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen des HFHC-induzierten NASH-Modells förderte ein Laptm5-Mangel offensichtlich MCD-diätbedingte Leberstoffwechselstörungen und Leberschäden (ergänzende Abbildung 6a – g). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Depletion von Laptm5 die NASH bei Mäusen verschlimmert.

Um die Rolle von hepatischem Laptm5 bei der NASH-Pathogenese zu bestätigen, konstruierten wir ein Hepatozyten-spezifisches transgenes Laptm5-Mäusemodell (Laptm5-HTG) (ergänzende Abbildungen 7a und b), wobei die Wurfgeschwister (NTG) als Kontrollen dienten. HTG-Mäuse zeigten ein geringeres Lebergewicht und Leber-Körpergewicht-Verhältnis, es wurde jedoch 16 Wochen nach der HFHC-Fütterung keine signifikante Veränderung des Körpergewichts im Vergleich zu den NTG-Mäusen beobachtet. HFHC-induzierter höherer Blutzucker und verschlechtertes Lipidprofil wurden auch durch die Überexpression von Laptm5 gemildert (ergänzende Abbildung 7c – g). Darüber hinaus zeigten die HTG-Mäuse eine weniger schwere Lebersteatose als ihre NTG-Gegenstücke (ergänzende Abbildung 7h, i). In Übereinstimmung mit den oben genannten Ergebnissen linderte die Überexpression von Laptm5 Entzündungen, Fibrose und Leberschäden während der NASH-Progression erheblich (ergänzende Abbildung 7j – p). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass LAPTM5 vor Steatohepatitis und ihren metabolischen Komplikationen schützt.

Um den Mechanismus, der dem LAPTM5-induzierten Schutz gegen NASH zugrunde liegt, besser zu verstehen, haben wir die Ergebnisse der RNA-Sequenzierung und der Signalweganalyse der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) integriert und festgestellt, dass Laptm5-Knockout den MAPK-Signalweg am deutlichsten verändert (Abb. 6a). ). Western Blot bestätigte, dass der MAPK-Signalweg durch die Überexpression von Laptm5 unterdrückt, durch die Deletion von Laptm5 jedoch sowohl in vitro als auch in vivo verstärkt wurde (Abb. 6b – e). Um das spezifische Ziel zu identifizieren, das die Unterdrückung des MAPK-Signalwegs vermittelt, führten wir eine IP-Massenspektrometrie an Laptm5-überexprimierenden L02-Hepatozyten durch und entdeckten, dass LAPTM5 mit dem kleinen GTP-bindenden Protein CDC42 interagierte (Zellteilungszyklus 42) (Abb. 6f). , von dem berichtet wurde, dass es ein Hauptaktivator des durch gesättigte Fettsäuren stimulierten JNK-Signalwegs in Hepatozyten ist26. Anschließend bestätigten wir, dass die Überexpression von CDC42 die Lipidansammlung und die Entzündungsreaktion erheblich verschlimmerte und die Aktivierung des MAPK-Signalwegs in Hepatozyten förderte. Dieser Befund stimmt mit den zuvor berichteten Ergebnissen überein (ergänzende Abbildung 8a – e). Anschließend wurde die Wechselwirkung zwischen LAPTM5 und CDC42 durch CO-IP- und GST-Assay weiter bestätigt (Abb. 6g, h), und darüber hinaus war die Wechselwirkung bei PA-Stimulation robuster (Abb. 6i). Darüber hinaus hemmte die Überexpression von Laptm5 die Proteinexpression von CDC42 unter PA-Stimulation, hatte jedoch unter BSA-Bedingungen keinen solchen Effekt, wobei die Ergebnisse sowohl in L02-Zellen als auch in primären Hepatozyten überprüft wurden (Abb. 6j, k). Während Laptm5-Knockout die CDC42-Expression unter PA-Stimulation förderte, stimmte dies ebenfalls nicht mit dem Ergebnis im BSA-Zustand überein (Abb. 6l). Anschließend untersuchten wir die Proteinspiegel von CDC42 im Lebergewebe von NASH- oder Nicht-NASH-Individuen weiter und stellten fest, dass die CDC42-Expression in der NASH-Gruppe signifikant hochreguliert war, was darauf hindeutet, dass LAPTM5 und CDC42 negativ korrelierten (Abb. 6m). und zwischen LAPTM5 und CDC42 existierte eine NASH-regulierende Achse. Um den spezifischen Weg des LAPTM5-vermittelten CDC42-Proteinabbaus zu identifizieren, wurden die LAPTM5 überexprimierenden Zellen sowohl mit MG132 als auch mit Chlq behandelt. Wir fanden heraus, dass der lysosomale Inhibitor Chlq die hemmende Wirkung von LAPTM5 auf CDC42 aufheben kann (Abb. 6n, o). Liang et al. und Guo et al. zeigten, dass LAPTM5 das Fortschreiten verschiedener systemischer Erkrankungen wie Tumoren und HIV regulieren kann, indem es den lysosomalen Abbau relevanter Proteine ​​fördert. Daher kamen wir zu der Hypothese, dass die Herunterregulierung von CDC42 durch den lysosomalen Abbau von LAPTM5 vermittelt wurde. Darüber hinaus zeigte die Immunfluoreszenz-Co-Lokalisierungsfärbung, dass CDC42 unter BSA-Bedingungen gleichmäßig im Zytoplasma verteilt war (ergänzende Abbildung 8f). Nach der PA-Behandlung bewegte sich CDC42 jedoch allmählich in Richtung Lysosomen, wurde körnig und lokalisierte sich schließlich zusammen mit Lysosomen in den Zellen, die LAPTM5 überexprimierten, was darauf hindeutet, dass LAPTM5 den lysosomalen endozytischen Transport von CDC42 erleichterte und seinen Abbau durch Lysosomen förderte (Abb. 6p).

a Kombinierte KEGG-Analyseergebnisse zeigen den am stärksten angereicherten MAPK-Signalweg. b und c Western-Blot-Bilder (b) und quantitative Ergebnisse (c) der phosphorylierten und Gesamtproteinspiegel von p38, JNK1/2 und ERK1/2 in Mäuselebern der angegebenen Gruppen (n = 3 Mäuse/Gruppe). Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar. Zur Bewertung der Unterschiede wurde ein zweiseitiger Student-T-Test verwendet. d und e Western-Blot-Bilder, die die phosphorylierten und Gesamtproteinspiegel von p38, JNK1/2 und ERK1/2 in den Zellen der angegebenen Gruppe zeigen. f Schema zur Identifizierung des mit LAPTM5 interagierenden Proteins durch Analyse von IP-MS. g und h Co-IP (g) und GST-Pulldown (h) zeigen die Interaktion zwischen LAPTM5 und CDC42. i Co-IP-Assays zur Untersuchung des Unterschieds in der Bindungsstärke zwischen LAPTM5 und CDC42 nach der Stimulation von PA. j und k Western-Blot-Ergebnisse der exogenen (j) und endogenen (k) CDC42-Expression nach Überexpression verschiedener Konzentrationen von LAPTM5. (l) Western-Blot-Bilder (oben) und quantitative Analyse (unten) der CDC42-Expression in Hepatozyten von LAPTM5-KO-Mäusen nach PA-Stimulation (n = 3 Mäuse/Gruppe). Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar, und zur Bewertung der Unterschiede wurde eine einfache ANOVA des Bonferroni-Post-hoc-Tests verwendet. m Western-Blot-Bilder der LAPTM5- und CDC42-Expression in der Gruppe von NASH oder Nicht-NASH (n = 5 Personen/Gruppe). n Western-Blot-Ergebnis der exogenen CDC42-Expression nach LAPTM5-Überexpression unter Chlq- oder MG132-Behandlung. o Western-Blot-Bilder des exogenen CDC42-Expressionstrends mit LAPTM5-Überexpression in einem Gradienten unter der Behandlung von Chlq. p Konfokalmikroskopische Bilder der Co-Lokalisierung von LAMP1 (grün) und CDC42 (rot) in L02-Zellen in den angegebenen Gruppen (Kerne, blau). Maßstabsbalken, 8 μm (n = 3 unabhängige Experimente). PAOA, 0,5 mM/1,0 mM; PA, 0,5 mM, OA, 1,0 mM. Chlq, 50 μM; MG132, 50 μM. Immunoblots sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes haben wir versucht, das Vorhandensein der LAPTM5-CDC42-Regulationsachse bei der NASH-Progression zu validieren. Wir induzierten eine Überexpression von CDC42 in Laptm5-überexprimierenden Hepatozyten. Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine Überexpression von CDC42 die schützende Wirkung von LAPTM5 auf Lipidstoffwechselbelastungen aufheben kann, wie z. B. das ungünstige Lipidprofil und den hochregulierten MAPK-Signalweg, wenn CDC42 überexprimiert wurde (Abb. 7a – d). Im Gegenteil, der Abbau von CDC42 verhinderte erfolgreich die Verschlimmerung der Lipidansammlung und Entzündung in Hepatozyten, als Laptm5 ausgeschaltet wurde (Abb. 7e – h). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass LAPTM5 eine schützende Rolle bei NASH spielt, indem es die Proteinhomöostase von CDC42 vermittelt.

Eine Western-Blot-Analyse der Gesamt- und Phosphorylierung von JNK1/2 und p38 nach Überexpression zeigte Plasmide in L02-Zellen an. b–d Nilrot-Färbung (b) und TG-Gehalt (d) von L02-Zellen nach Behandlung mit PAOA in den angegebenen Gruppen. Maßstabsbalken, 25 μm (n = 3 unabhängige Experimente). e Western-Blot-Analyse von primären Laptm5-Knockout-Hepatozyten, die in den angegebenen Gruppen mit dem CDC42-Knockdown-Adenovirus infiziert waren. f–h Nilrot-Färbung (f) und TG-Gehalt (h) der primären Hepatozyten nach Behandlung von PAOA in den angegebenen Gruppen (n = 3 unabhängige Experimente). PAOA, 0,5 mM/1,0 mM; PA, 0,5 mM, OA, 1,0 mM. Chlq, 50 μM; MG132, 50 μM. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar. Eine einfache ANOVA des Bonferroni-Post-hoc-Tests wurde verwendet, um Unterschiede in (c, d) und (g, h) zu bewerten. Immunoblots sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Schließlich untersuchten wir die therapeutische Wirkung der gezielten Ausrichtung auf die LAPTM5-CDC42-Achse bei NASH. Adenovirus, das Laptm5 (AdLAPTM5) überexprimiert, wurde Mäusen injiziert, die 8 Wochen lang eine HFHC-Diät erhalten hatten. Anschließend wurden die Mäuse weitere 4 Wochen mit der HFHC-Diät gefüttert, AdGFP diente als Kontrolle (Abb. 8a). Die Western-Blot-Analyse bestätigte, dass LAPTM5 überexprimiert war und die Expression von p-JNK1/2 und CDC42 in den Lebern von mit AdLAPTM5 behandelten Mäusen herunterreguliert war (Abb. 8b). Im Vergleich zu den AdGFP-Mäusen zeigten Mäuse, denen AdLAPTM5 injiziert worden war, dass der Nüchternblutzucker, das Lebergewicht und das Verhältnis von Lebergewicht zu Körpergewicht signifikant verringert waren (Abb. 8c, d). Darüber hinaus verbesserte die Adenovirus-vermittelte Überexpression von Laptm5 die Lipidansammlung, Entzündung und Leberschädigung in den Lebern von mit HFHC gefütterten Mäusen erheblich (Abb. 8e – m). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse stark darauf hin, dass LAPTM5 gute Aussichten hat, als therapeutisches Ziel für die Behandlung von NASH und Stoffwechselstörungen zu dienen.

ein Schema zur Konstruktion von AdLAPTM5-vermittelten therapeutischen NASH-Modellen in HFHC-Mäusen. b Stellt die WB-Erkennungsergebnisse der in den Gruppen angegebenen Proteine ​​dar (n = 3 Mäuse/Gruppe). c und d Nüchternblutzucker (c), Lebergewicht und LW/BW (d) von Mäusen in den angegebenen Gruppen (n = 10 Mäuse/Gruppe). e Hepatischer TG- und TC-Gehalt von Mäusen in der angegebenen Gruppe (n = 10 Mäuse/Gruppe). f H&E (oben) (n = 6 Mäuse/Gruppe) und Oil Red O (unten) (n = 5 Mäuse/Gruppe) Färbung in den Leberschnitten. Maßstabsbalken, 100 μm. g NAS-Score-Analyse der Gruppe in Panel (f) (n = 6 Mäuse/Gruppe). h Statistische Analyse von Oil Red O in der Gruppe des Panels (f) (n = 5 Mäuse/Gruppe). i Relative mRNA-Spiegel von Genen im Zusammenhang mit dem Fettsäurestoffwechsel in der Leber von Mäusen in den angegebenen Gruppen (n = 6 Mäuse/Gruppe). j und k Immunfluoreszenzfärbung (j) und statistische Analyse (k) von CD11b (rot) in den Leberschnitten von mit HFHC gefütterten Mäusen in den angegebenen Gruppen (n = 5 Mäuse/Gruppe). Maßstabsbalken, 50 μm. l Relative mRNA-Spiegel proinflammatorischer Gene in der Leber von Mäusen in den angegebenen Gruppen (n = 6 Mäuse/Gruppe). m Serum-ALT- und AST-Konzentrationen von Mäusen in den angegebenen Gruppen (n = 10 Mäuse/Gruppe). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Zur Bewertung der Unterschiede in allen Panels wurde ein zweiseitiger Student-T-Test verwendet. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass LAPTM5 unter metabolischem Stress durch NEDD4L ubiquitiniert abgebaut werden könnte. Überexpression von LAPTM5 schwächte Lebersteatose, Entzündungsreaktion und Fibrose ab. Mechanistisch gesehen kann LAPTM5 direkt an CDC42 binden, seinen lysosomalen Abbau fördern und dann die Aktivierung des c-Jun-NH2-terminalen Kinase-Signalwegs hemmen und so seine Funktion erfüllen. Hepatozyten LAPTM5 ist ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für NASH.

LAPTM5 ist ein multispannendes Transmembranprotein, das ein Ubiquitin-interagierendes Motiv (UIM) und drei PY-Motive enthält, die Nedd4-WW-Domänen binden. Gleichzeitig rekrutiert der NEDD4-LAPTM5-Komplex die Bindung von ubiquitiniertem GGA3 an LAPTM5-UIM27. In einer früheren Studie wurde berichtet, dass die E3-Ubiquitin-Ligase ITCH über den Ubiquitinierungsweg an LAPTM5 bindet und dieses negativ reguliert28. Unsere Studie zeigte, dass LAPTM5 in NASH-Modellen signifikant verringert war und seine Herunterregulierung über den Ubiquitin-Proteasom-Weg erfolgte. Dann fanden wir heraus, dass NEDD4L- und E3-Ubiquitin-Ligasen mit LAPTM5 interagierten und die K48-verknüpfte Ubiquitinierung von LAPTM5 förderten. Folglich könnte die gezielte Behandlung des physiologischen Regelkreises von NEDD4L-LAPTM5 eine wirksame Strategie zur Behandlung von NASH sein.

Die molekularen Mechanismen, die der Pathogenese von NASH zugrunde liegen, sind multifaktoriell und kompliziert.29 Mehrere Studien haben gezeigt, dass der MAPK-Signalweg an der Entwicklung und dem Fortschreiten von NASH beteiligt ist. Eine fettreiche Ernährung könnte die Expression von JNK in der Leber aktivieren30. In zellulären NASH-Modellen aktivierte die gesättigte Fettsäure (Palmitinsäure) PPARα, was zu einer c-JNK-abhängigen mitochondrialen Dysfunktion und zum Tod von Hepatozyten führte31. Der P38-Signalweg spielt eine wichtige Rolle bei der durch Entzündungen ausgelösten Zellreaktion und der stressinduzierten Zellapoptose32. Glowacka et al. und Chen et al. bewiesen, dass LAPTM5 eine bedeutende Rolle bei der Modulation und Aktivierung des MAPK-Signalwegs spielt15,33. In dieser Studie zeigte die bioinformatische Analyse in Kombination mit molekularen Studien, dass die Aktivierung von JNK1/2 und p38 durch die Überexpression von LAPTM5 gehemmt, aber durch die Deletion von LAPTM5 in NASH-Modellen verstärkt wurde.

Darüber hinaus haben neuere Studien dokumentiert, dass die kleinen GTP-bindenden Proteine ​​CDC42 eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von NASH spielen, indem sie die Aktivierung des MAPK-Signalwegs modulieren34. Die Aktivierung von CDC42 ist für die SFA-stimulierte MLK3-abhängige Aktivierung von JNK in Hepatozyten erforderlich, und eine verminderte Expression von CDC42 kann die Aktivierung von JNK26 abschwächen. In Übereinstimmung mit diesen Erkenntnissen ergab unsere Studie, dass LAPTM5 mit CDC42 interagierte und dessen Expression regulierte. Darüber hinaus hob die Überexpression von CDC42 die schützende Wirkung von LAPTM5 auf den Lipidstoffwechsel auf. LAPTM5 modulierte hauptsächlich das Fortschreiten von NASH, indem es die Expression von CDC42 und die Aktivierung des MAPK-Signalwegs regulierte.

Die Wechselwirkung zwischen LAPTM5 und CDC42 muss noch geklärt werden. LAPTM5 ist in der lysosomalen Membran lokalisiert und an einer Vielzahl pathologischer und physiologischer Prozesse beteiligt. Kawai et al. berichteten, dass LAPTM5 die lysosomale Translokation und den Abbau von CD3ζ14 förderte. Ouchida et al. zeigten, dass LAPTM5 mit BCR interagierte und dessen lysosomalen Abbau in Maus-B-Zellen förderte35. In der Zwischenzeit haben mehrere neuere Studien gezeigt, dass LAPTM5 das Fortschreiten einiger systemischer Erkrankungen wie bösartigen Erkrankungen und HIV regulieren kann, indem es den lysosomalen Abbau relevanter Proteine ​​fördert36,37. Darüber hinaus spielt auch der lysosomale Abbauweg eine wichtige Rolle bei der Progression von NASH. Frühere Studien haben gezeigt, dass TMBIM1 den lysosomalen Abbau von TLR4 fördert und die durch fettreiche Ernährung verursachte Insulinresistenz, Lebersteatose und Entzündungen hemmt38. In der vorliegenden Studie haben wir herausgefunden, dass LAPTM5 die lysosomale Lokalisierung und den Abbau von CDC42 unter der Stimulation von PA fördern kann. Allerdings wurden die Expression und Lokalisierung von CDC42 unter der BSA-Bedingung nicht beeinflusst. Dies weist darauf hin, dass sich die Korrelation zwischen LAPTM5 und CDC42 nach der Behandlung von PA möglicherweise verändert hat. Beispielsweise kann es nach der PA-Stimulation zu einigen Veränderungen in den Proteindomänen und der molekularen Aktivität von LAPTM5 und CDC42 kommen. Youngshil et al. berichteten, dass die Proteintransport- und Sortierfunktionen von LAPTM5 durch verschiedene Domänen von it27 streng reguliert wurden. Manju et al. berichteten, dass die Aktivierung von CDC42 eine Schlüsselrolle bei der Regulierung des Krankheitsverlaufs spielt und dass die Aktivitätsintensität von CDC42 auch dessen biologische Funktion beeinflusst26. Daher kann es nach der PA-Stimulation zu empfindlichen und komplexen Veränderungen im Inneren der Zellen gekommen sein. Und diese tiefgreifenden Mechanismen erfordern weitere Untersuchungen.

Zusammenfassend haben wir in dieser Studie LAPTM5 als einen nicht gemeldeten Suppressor von NASH identifiziert, der den p38/c-JNK-Signalweg negativ regulieren könnte, indem er den Abbau von CDC42-Lysosomen in Hepatozyten fördert. Unsere Studie zeigte, dass die Adenovirus-vermittelte Laptm5-Therapie gegen NASH wirksam war und die LAPTM5-Proteinexpression mit dem klinischen Fortschreiten von NASH korrelierte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die gezielte Behandlung von Hepatozyten-spezifischem Laptm5 eine wirksame therapeutische Alternative zur Behandlung von NASH sein kann und weiterer präklinischer Forschung bedarf.

Einige Fragen zur Rolle von LAPTM5 bei der Behandlung von NASH müssen noch beantwortet werden. Wie transportiert LAPTM5 beispielsweise CDC42 zum Lysosom für dessen Proteinabbau und wie läuft der Prozess konkret ab? Wie reguliert CDC42 die Aktivität der nachgeschalteten p38- und JNK1/2-Signalwege? Alle diese Probleme erfordern eine weitere Untersuchung. Darüber hinaus muss die Korrelation zwischen LAPTM5 und NASH noch durch groß angelegte klinische Studien weiter verifiziert werden. Unser Experiment wurde an Mäusen durchgeführt und es sind Studien mit NASH-Modellen größerer Tiere wie Primaten erforderlich, bevor mit klinischen Studien begonnen werden kann.

Die in dieser Studie verwendeten Schlüsselreagenzien, Antikörper und Primer sind in den ergänzenden Materialien aufgeführt.

Alle in dieser Studie beschriebenen Tierpflege- und damit verbundenen Experimente wurden gemäß den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, die von den US National Institutes of Health (NIH-Veröffentlichung, 8. Auflage, 2011) erstellt wurden. Die Institutional Animal Care and Use Committees des Tongji Medical College und der Huazhong University of Science and Technology genehmigten die in dieser Studie verwendeten Tierprotokolle.

Erwachsene 8–10 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse mit einem Gewicht von 22–30 g wurden unter pathogenfreien Bedingungen in einer temperaturkontrollierten Umgebung bei 22–24 °C und einer feuchtigkeitskontrollierten Umgebung bei 40–70 % unter einem Dach gehalten 12-stündiger Hell-Dunkel-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Wasser und Nahrung. Mäuse waren im Allgemeinen bei guter Gesundheit, bevor HFD (Protein, 20 %; Fett, 60 %; Kohlenhydrate, 20 %; H10060, Beijing HUAFUKANG Bioscience Co., Ltd) 24 Wochen lang zur Etablierung eines Fettlebermodells, HFHC (42 % Fett, 44 % Kohlenhydrate, 14 % Protein und 0,2 % Cholesterin; TP26304; Trophic Diets, Nantong, China) Diät für 16 Wochen, MCD (TP3005G; Trophic Diets, Nantong, China) Diät für 4 Wochen zur Etablierung des NASH-Modells oder NCD ( Protein, 18 %, Fett, 4 %, Kohlenhydrate, 78 %, 1010001, Jiangsuxietong, China) und MCS (TP3005GS; Trophic Diets, Nantong, China). Die zervikale Luxation wurde zur Euthanasie von Mäusen verwendet. Alle Tiere wurden in der Abteilung für Labortierressourcen des Tongji Medical College gefüttert und gezüchtet.

Die Entnahme und Anwendung menschlicher Proben erfolgte unter der Aufsicht der Ethikkommission des Renmin-Krankenhauses der Universität Wuhan mit der Ethiknummer WDRY2018-K001 und entsprach den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki. Alle Personen haben eine Einverständniserklärung zur Verwendung klinischer Proben in der vorliegenden Studie unterzeichnet.

Wir haben menschliche steatotische Leberproben von Patienten mit einfacher Steatose oder NASH erhalten, die sich einer Leberbiopsie oder Lebertransplantation unterzogen hatten. Die nicht-steatotischen Leberproben wurden aus gesunden Leberregionen von Spendern entnommen, die sich aufgrund von Leberzysten oder Leberhämangiomen einer Leberresektion unterzogen hatten. Personen, die an dieser Studie teilnahmen, waren von einer Hepatitis-Virus-Infektion, Drogenmissbrauch oder übermäßigem Alkoholkonsum (>140 g für Männer oder >70 g für Frauen pro Woche) ausgeschlossen. Die Leberproben von Patienten stammen aus der Nicht-NASH-Gruppe mit 16 Personen und der NASH-Gruppe mit 20 Personen. In der Nicht-NASH-Gruppe gibt es 9 weibliche und 7 männliche Patienten im Alter zwischen 27 und 67 Jahren. In der NASH-Gruppe gibt es 13 weibliche und 7 männliche Patienten im Alter zwischen 19 und 40 Jahren.

Laptm5-flox-Mäuse wurden mit dem CRISPR/Cas9-System im C57BL/6-Hintergrund erzeugt. Zwei einzelne Guide-RNAs (sgRNAs) (in Tabelle S1 aufgeführt), die auf die Laptm5-Introns 1 und 2 abzielen, wurden mit einem Online-CRISPR-Designtool (http://chopchop.cbu.uib.no/) entworfen. sgRNA-Expressionsvektoren wurden unter Verwendung eines pUC57-sgRNA-Rückgrats (Addgene, 51132) konstruiert. Wir haben außerdem einen Donorvektor entworfen, der zwei homologe Arme, eine mittlere kodierende Region (CDS) und zwei loxP-Sequenzen in derselben Richtung für die Reparatur homologer Rekombination enthielt. Anschließend wurden die sgRNA- und Cas9-Expressionsvektoren (Addgene, 44758) in vitro transkribiert und die in vitro erhaltene mRNA-Mischung mit dem Donorvektor mithilfe eines Mikroinjektionsgeräts in die Zygoten von Mäusen injiziert. Die injizierten Zygoten wurden dann in die Gebärmutter der Empfängermäuse transplantiert und durch Genotypisierung wurden Laptm5-flox-Mäuse gewonnen. Anschließend wurden Gründermäuse mit C57BL/6-Mäusen gepaart, bis Laptm5-flox/flox-Mäuse erhalten und mit leberspezifischen transgenen Alb-Cre-Mäusen (JAX, 003574) gepaart wurden. Laptm5-flox/flox/Alb Cre-Mäuse (Laptm5-HepKO) wurden gescreent. Die verwendeten Identifikationsprimer sind in den Tabellen P1–P5 aufgeführt.

Die CDS-Region von Laptm5 wurde aus Maus-cDNA amplifiziert, die durch reverse Transkription erhalten wurde, um den pALB-Überexpressionsvektor zu konstruieren. Korrekt sequenzierte Plasmide wurden durch PvuI-Restriktionsendonuklease linearisiert; Die gewonnenen Fragmente wurden gereinigt und für die Mikroinjektion verwendet. Anschließend wurden Mäuse der F0-Generation gewonnen und identifiziert. Die ersten positiven Mäuse wurden mit dem Wildtyp gepaart, und die positiven Mäuse der F1-Generation wurden zur Paarung ausgewählt, um einen stabilen genetischen leberspezifischen transgenen Laptm5-Mausstamm zu erhalten. Die verwendeten Primer sind in Tabelle S3 aufgeführt.

Primäre Hepatozyten wurden aus 6 bis 8 Wochen alten männlichen C57BL/6-Mäusen isoliert. Die Mäuse wurden kurzzeitig betäubt und dann wurde die Bauchhöhle geöffnet. Die untere Hohlvene der Leber wurde mit Spüllösung durchspült, bis die Leber gelb wurde. Schließlich wurde die Spüllösung, die 0,05 % IV-Kollagenase enthielt, zum Verdauen der Leber verwendet. Anschließend wurde die Leber entnommen und die Leberkapsel mit einer Mikropinzette geöffnet. Anschließend wurden die Gewebe durch ein 100-μm-Zellsieb filtriert, um primäre Hepatozyten zu erhalten, die dann 3 Minuten lang bei 50 × g zentrifugiert und in einer 50 %igen Percoll-Lösung gereinigt wurden. Die gereinigten primären Hepatozyten wurden in DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin in einem mit 5 % Kohlendioxid/Wasser gesättigten Inkubator bei 37 °C kultiviert.

Menschliche Hepatozyten-L02-, menschliche embryonale Nieren-293- und 293T-Zelllinien wurden von der Type Culture Collection der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erworben. Alle Zelllinien wurden auf Mykoplasmenkontamination untersucht und die Ergebnisse waren negativ. Die Zellen wurden in DMEM, das 10 % fötales Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin enthielt, in einem mit 5 % Kohlendioxid/Wasser gesättigten Inkubator bei 37 °C kultiviert. Vor den Experimenten wurden alle Zelllinien durch kurze Tandem-Repeat-DNA-Profilierung verifiziert. Alle Zelllinien in unserem Labor wurden nach der Wiederbelebung höchstens 30 Mal passagiert und routinemäßig mittels PCR auf Mykoplasmenkontamination getestet. Um ein Lebersteatosemodell in vitro zu etablieren, wurden primäre Hepatozyten und L02-Zellen der Maus mit Palmitinsäure (PA; 0,5 mM; P0500; Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, USA) und Ölsäure (OA; 1,0 mM; O) stimuliert -1008; Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, USA) (gelöst in 0,5 % fettsäurefreiem BSA) bei den angegebenen Konzentrationen für 12–24 Stunden. Für die Kontrollgruppe wurden die Zellen mit fettsäurefreiem BSA (0,5 %; BAH66-0100; Equitech Bio, Kerrville, TX, USA) stimuliert. Um festzustellen, ob LAPTM5 den proteasomalen Abbau von CDC42 erleichtert, wurden die Zellen 12 Stunden lang mit 50 μmol/l Chlq (S6999; Selleck Chemicals) behandelt.

Der Nüchternblutzuckerspiegel und das Körpergewicht der Mäuse wurden alle 4 Wochen bestimmt, und der Nüchternblutzuckerspiegel wurde mit einem Blutzuckermessgerät (Life Scan, Milpitas, CA, USA) gemessen. Die TC-, ALT- und AST-Konzentrationen im Serum wurden mit einem ADVIA 2400 Chemistry System Analyzer (Siemens, Tarrytown, NY, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

Der TG- und TC-Gehalt (290-63701 für TG, 294-65801 für TC; Wako; Tokio, Japan) von primären Hepatozyten, L02-Zellen und Lebergeweben wurde unter Verwendung kommerzieller Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

Das Lebergewebe von Mäusen wurde 48 Stunden lang mit 10 % Formaldehyd fixiert, und der Gewebeblock wurde anschließend durch Gewebetrocknung zugeschnitten und eingebettet. Die im OCT eingebetteten Leberschnitte wurden mit Oil Red O (O0625; Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, USA) gefärbt und die in Paraffin eingebetteten Leberschnitte wurden mit H&E (Hematoxylin, G1004, Servicebio, Wuhan, China; Eosin) gefärbt , BA-4024, Baso, Zhuhai, China) und Picrosiriusrot (PSR; 26357-02; Hede Biotechnology; Peking, China), die für Leberfibrosetests verwendet wurden. Alle histologischen Bilder wurden mit einem Lichtmikroskop (ECLIPSE 80i; Nikon, Tokio, Japan) aufgenommen.

Die Immunhistochemie zur Analyse von PPARγ und der CD11b-Expression wurde an in Paraffin eingebetteten Leberschnitten (5 μm) unter Verwendung von PPARγ (1:400-Verdünnung, 2435T, Cell Signaling Technology), CD11b (1:4000-Verdünnung, BM3925, Boster; Wuhan, China) durchgeführt. und LAPTM5-Antikörper (1:200-Verdünnung, sc134676, Santa Cruz). Zur Antigengewinnung wurden die Proben 5 Minuten lang in einem Schnellkochtopf in Citratgewebe-Antigengewinnungslösung mit einem pH-Wert von 6,0 erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden die Proben 20 Minuten lang in 3 %iges H2O2 gelegt, um die endogene Peroxidaktivität zu löschen. Anschließend wurden die Objektträger nach dem Waschen mit PBS 30 Minuten lang mit 10 % BSA blockiert. Anschließend wurden die Schnitte mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C inkubiert, nachdem sie dreimal mit PBS gewaschen wurden (5 Minuten/Waschgang), wobei die Schnitte mit dem Rabbit Two-step Detection Kit (PV-9001, ZSGB-BIO; Peking, China) inkubiert wurden das Protokoll des Herstellers. Die immunhistochemische Färbung wurde unter Verwendung eines 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Substratkits (ZLI-9018; ZSGB-BIO, Peking, China) und einer Hämatoxylin-Gegenfärbung sichtbar gemacht. Die Bilder wurden mit einem Lichtmikroskop (ECLIPSE 80i; Nikon, Tokio, Japan) aufgenommen.

Um eine CD11b-Immunfluoreszenzfärbung durchzuführen, wurden Paraffinschnitte von Lebergeweben nach der Antigengewinnung zunächst mit einem Anti-CD11b-Primärantikörper (1:800-Verdünnung, BM3925, Boster; Wuhan, China) über Nacht bei 4 °C markiert und dann mit einem Fluorophor inkubiert -konjugierter Sekundärantikörper [Alexa Fluor 568 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L); A11036; Invitrogen; Carlsbad, CA, USA] bei 37 °C für 1 Stunde. Die Immunfluoreszenzbilder wurden mit dem Fluoreszenzmikroskop (BX51; Olympus, Tokio, Japan) aufgenommen.

L02-Zellen und primäre Hepatozyten der Maus wurden 0, 12 oder 24 Stunden lang mit PAOA behandelt. Anschließend wurden die Zellen 15 Minuten lang mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit Nilrot (1 mM in PBS; 22190; Fanbo Biochemicals; Peking, China) angefärbt. Die Lipidansammlung wurde mithilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (TCS SP8; Leica, Wetzlar, Deutschland) oder eines High-Content-Analysesystems (Operetta CLS, Waltham, MA, USA) sichtbar gemacht und quantifiziert.

Zur Deckglasfärbung wurden die mit verwandten Plasmiden transfizierten L02-Hepatozyten mit Maus-Anti-LAMP1- und Kaninchen-Anti-CDC42-Antikörpern 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und anschließend mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern markiert. Die Kerne in allen Bildern wurden mit DAPI (S36939; Invitrogen; Carlsbad, CA, USA) gefärbt und die Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (TCS SP8; Leica; Wetzler, Deutschland) aufgenommen. Vor der Farbstoffbeladung wurden die Zellen 12 Stunden lang mit PA (0,5 mM) in Gegenwart von Chlq (50 μM) behandelt.

Die PCR-Produkte lysosomaler Transmembranproteine ​​wurden aus cDNA-Bibliotheken gewonnen und in entsprechende Vektoren kloniert, um überexprimierte Plasmide zu erhalten. Vollständige Sequenzen der humanen kodierenden Regionen LAPTM5, NEDD4, WWP2, ITCH und CDC42 wurden in die Vektoren pcDNA5-HA, pcDNA5-Flag, pcDNA5-Myc und pcDNA5-GST-HA subkloniert, um Flag-LAPTM5, HA-NEDD4, HA zu erzeugen -WWP2, HA-ITCH, Myc-CDC42, GST-HA-LAPTM5 bzw. GST-HA-CDC42 rekombinante Plasmide. In ähnlicher Weise wurden die vollständigen Sequenzen von menschlichem NEDD4L in den pcDNA3.1-HA-Vektor eingefügt, um HA-NEDD4L zu erzeugen, und dann wurde HA-NEDD4L(C943S) amplifiziert. Das Lentivirus-Paketsystem umfasste zwei Verpackungsplasmide, pMD2.G und psPAX2, und ein Zielphagen-Flag-LAPTM5-Plasmid. Sie wurden gemischt und zusammengesetzt, um HEK 293 T-Zellen zu infizieren. Nach 48 Stunden Infektion wurde der Überstand der HEK 293-T-Zellen gesammelt, um L02-Zellen mit Polybren (8 μM; H9268; Sigma, St. Louis, MO, USA) zu infizieren und die Transfektion zu unterstützen. Puromycin (A1113803; Gibco, Grand Island, NY, USA) wurde verwendet, um stabile Zelllinien mit LAPTM5-Überexpression zu erzeugen, und lentivirales grün fluoreszierendes Protein (Lenti-GFP) wurde als Kontrolle verwendet.

Das Shuttle-Plasmid pENTR-U6-CMV-flag-T2A-EGFP und das ViraPower Adenoviral Expression System (V493-20; Invitrogen; Carlsbad, CA, USA) wurden verwendet, um Maus-LAPTM5-überexprimierende adenovirale Vektoren zu erzeugen. Nach der Linearisierung mit Pacl (R0547L; NEB, MA, USA) wurden die adenoviralen Vektoren unter Verwendung eines Polyethylenimin-Transfektionsreagenzes (24765-1; Polysciences, Warrington, UK) in 293-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden nach 6–7 Tagen geerntet, um das anfängliche Adenovirus zu erhalten. Nach drei Amplifikationsgenerationen wurde das LAPTM5-Adenovirus durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und der Titer mit der Methode der 50 % Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) gemessen. Primäre Hepatozyten von Mäusen wurden mit Adenovirus bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 50 infiziert. Für In-vivo-Tests wurde Adenovirus, das Maus-LAPTM5-Protein oder GFP (gekauft von HANBIO; Shanghai, China) exprimierte, 8 Wochen nach dem HFHC-Verzehr intraperitoneal injiziert.

Das Gesamtprotein wurde aus tierischen Geweben oder Zellen mit RIPA-Lysepuffer isoliert und lysiert, und die Proteine ​​wurden mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit (23225, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) quantifiziert. Gleiche Mengen der angegebenen Proteine ​​wurden auf ein 10 %iges SDS-PAGE-Gel geladen und auf PVDF-Membranen übertragen. Die PVDF-Membranen wurden anschließend mit 5 % Magermilch, gelöst in TBST, blockiert und mit entsprechenden Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C inkubiert, gefolgt von HRP-konjugierten Sekundärantikörpern für 1 Stunde. Anschließend wurden die Proteine ​​mit einem ECL-Kit nachgewiesen und mit dem ChemiDoc XRS+ Bildgebungssystem sichtbar gemacht.

Die gesamte mRNA wurde mit TRIzol aus tierischen Geweben und kultivierten Zellen extrahiert und die cDNA wurde mit den Reverse-Transkriptions-Reagenzien von Vazyme hergestellt. qPCR wurde mit SYBR Green gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die mRNA-Expressionsniveaus der verwandten Gene wurden auf die des Housekeeping-Gens β-Actin normalisiert.

Um die Wechselwirkungen zwischen Proteinen nachzuweisen, wurde eine Immunpräzipitation (IP) durchgeführt. Kurz gesagt, HEK293T- oder L02-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden cotransfiziert. Nach einer etwa 16–24-stündigen Transfektion wurden die Zellen unter Verwendung von eiskaltem 150 mM IP-Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA und 1 % NP-40), der einen Proteaseinhibitor enthielt, lysiert Cocktail (04693132001; Roche; Basel, BS, Schweiz). Nach der Zentrifugation (12.000 × g für 10 Minuten) wurde der Überstand in einem frischen EP-Röhrchen gesammelt. Jede Probe wurde anschließend 1 Stunde lang mit Protein A/G-Agarosekügelchen (AA104307; Bestchrom; Shanghai, China) und dann über Nacht bei 4 °C mit den angegebenen Antikörpern inkubiert. Nach der Zentrifugation (3500 × g für 5 Minuten) wurden die Perlen dreimal mit 300 mM IP-Lysepuffer und zweimal mit 150 mM IP-Lysepuffer gewaschen. Abschließend wurden die Perlen 15 Minuten lang in SDS-Ladepuffer auf 95 °C erhitzt und durch SDS-PAGE für den Western Blot aufgetrennt.

Mit den angegebenen Plasmiden cotransfizierte L02-Zellen wurden in 80 μl 150 mM IP-Lysepuffer und 10 μl 10 % SDS-Lysepuffer lysiert und dann durch 15-minütiges Erhitzen auf 95 °C denaturiert. Nach dem Erhitzen wurden 900 μl 150 mM IP-Lysepuffer, der einen Proteaseinhibitor-Cocktail enthielt, zu den Lysaten gegeben. Nach Ultraschallbehandlung und Zentrifugation (12.000 × g für 15 Minuten) wurde der Überstand gesammelt und mit den angegebenen Antikörpern und Protein A/G-Agarosekügelchen 3 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Die Perlen wurden nach Zentrifugation (3500 × g für 5 Minuten) entfernt und dreimal mit 500 mM IP-Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 500 mM NaCl; 1 mM EDTA und 1 % NP-40) gewaschen. Die Perlen wurden dann mit SDS-Ladepuffer 15 Minuten lang auf 95 °C erhitzt und wie zuvor beschrieben durch SDS-PAGE für Western Blot aufgetrennt.

Zur differenziellen Genexpressionsanalyse zwischen den verschiedenen Gruppen wurde die gesamte mRNA extrahiert und cDNA-Bibliotheken durch reverse Transkription erstellt. Single-End-Bibliotheken wurden mit einem BGISEQ 500 (MGI Tech; Shenzhen, China) sequenziert. Die Lesevorgänge wurden mithilfe der HISAT2-Software (Version 2.1.0) auf Referenzgenome von Ensembl-Mäusen (mm10/GRCm38)/Menschen (hg38/GRCh38) abgebildet. Binary Alignment Map (BAM)-Dateien wurden mit SAMtools (Version 1.4) generiert und Fragmente pro Kilobase des Exon-Modells pro Million kartierter Fragmente (FPKM)-Werte von Genen wurden mit StringTie (Version 1.3.3b) berechnet; DESeq2 (Version 1.2.10) wurde für die Analyse der differentiellen Genexpression verwendet. Gene mit einer Fold Change > 1,5 und entsprechenden angepassten P-Werten <0,05 wurden als DEGs identifiziert.

Wir haben den ungewichteten Durchschnittsentfernungsalgorithmus verwendet, um einen Clustering-Baum für die hierarchische Clustering-Analyse zu generieren. Die Genexpressionsniveaus jedes biologischen Replikats wurden mithilfe der Z-Score-Methode normalisiert.

Jeder Begriff des KEGG-Signalwegs oder biologischen GO-Prozesses und die beteiligten Gene wurden als Gensatz definiert, und eine Rangliste und ein „Gensatz“-Permutationstyp wurden unter Verwendung der „Signal2Noise“-Metrik generiert, um GSEA mithilfe des Java GSEA zu implementieren ( Version 3.0) Plattform.

Wir führten eine KEGG-Pathway-Anreicherungsanalyse mithilfe des exakten Fisher-Tests mit unserem hauseigenen R-Skript durch und luden KEGG-Pathway-Anmerkungen aus der KEGG-Datenbank herunter. Gleichzeitig wurden Pfade mit einem P-Wert <0,05 als signifikant angereicherte Pfade definiert.

Wir haben LAPTM5 und seine interagierenden Proteine ​​beschrieben, die im IP-Assay immunpräzipitiert wurden. Die Proteine ​​wurden einer Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse (LC-MS/MS) unterzogen. Die Standards für die Auswahl der Kandidatenmoleküle waren wie folgt: (1) Die Kandidaten müssen in der mit PAOA behandelten Gruppe vorhanden sein, in der mit BSA behandelten Gruppe jedoch verringert sein: (2) Die Anzahl der eindeutigen Peptide muss >2 sein.

Alle Daten wurden mit entsprechenden statistischen Methoden unter Verwendung der Software SPSS 21.0 analysiert. Unterschiede zwischen zwei Gruppen mit Normalverteilung wurden mithilfe des Student-t-Tests ermittelt. Für Vergleiche zwischen drei oder mehr Gruppen mit Normalverteilung wurde eine einfaktorielle ANOVA gefolgt vom Bonferroni-Post-hoc-Test (für Daten, die Homogenität der Varianz zeigen) oder dem Tamhane-T2-Post-hoc-Test (für heteroskedastische Daten) angewendet. Wenn die Daten einer nichtnormalen Verteilung entsprachen, wurde ein nichtparametrischer statistischer Kruskal-Wallis-Test verwendet. Die statistische Signifikanz wurde auf P < 0,05 festgelegt. Alle Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt und die verwendeten statistischen Methoden mit den entsprechenden P-Werten für die Daten werden in jeder Abbildungslegende erwähnt. Wir haben die Daten aus den Tierversuchen blind gesammelt und keine Daten wurden von der endgültigen statistischen Analyse ausgeschlossen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten RNA-seq-Daten wurden in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information Sequence Read Archive (SRA) unter den Zugangscodes PRJNA918313 (ID 918313 – BioProject – NCBI (nih.gov)) und PRJNA918311 (ID 918311 – BioProject) hinterlegt - NCBI (nih.gov)). Verarbeitete Daten der RNA-Sequenz menschlicher Lebern von klinischen NASH-Patienten und gesunden oder gesunden Adipositas-Patienten (Zugangsnummern: GSE66676, GSE63067, GSE61260, GSE48452, GSE162694_F4, GSE162694_F3, GSE162694_F2, GSE162694_F1, GSE162694_ F0, GSE130970), RNA-Sequenz der Leber Proben von Maus-NASH (Zugangsnummern: GSE93819, GSE57290_68W, GSE57290_38W, GSE53381, GSE51432) wurden aus der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank gesammelt. Alle anderen Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien und ergänzenden Tabellen verfügbar. Eine Berichtszusammenfassung für diesen Artikel ist als ergänzende Informationsdatei verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Febbraio, MA et al. Präklinische Modelle zur Untersuchung von NASH-gesteuertem HCC: Wie nützlich sind sie? Zellmetabolismus 29, 18–26 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Das, K. et al. Die nicht adipöse Bevölkerung in einem Entwicklungsland weist eine hohe Prävalenz einer nichtalkoholischen Fettleber und erheblicher Lebererkrankungen auf. Hepatology 51, 1593–1602 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lazarus, J. et al. Der globale NAFLD-Richtlinienüberprüfungs- und Vorbereitungsindex: Sind die Länder bereit, sich dieser stillen Herausforderung für die öffentliche Gesundheit zu stellen? J. Hepatol. 76, 771–780 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yu, Y., Cai, J., She, Z. & Li, H. Einblicke in die Epidemiologie, Pathogenese und Therapie nichtalkoholischer Fettlebererkrankungen. Adv. Wissenschaft. 6, 1801585 (2019).

Artikel Google Scholar

David, D. & Eapen, CE Was sind die aktuellen pharmakologischen Therapien für nichtalkoholische Fettlebererkrankungen? J. Clin. Exp. Hepatol. 11, 232–238 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chen, Z., Yu, Y., Cai, J. & Li, H. Neue molekulare Ziele für die Behandlung nichtalkoholischer Fettlebererkrankungen. Trends Endokrinol. Metab. 30, 903–914 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Chen, M., Cai, J., Yu, Y., She, Z. & Li, H. Aktuelle und neue Ansätze für die Behandlung von nichtalkoholischer Steatohepatitis. Genexpr. 19, 175–185 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Trivedi, P., Bartlett, J. & Pulinilkunnil, T. Lysosomale Biologie und Funktion: moderne Sicht auf den Zellmüllbehälter. Zellen 9, 1131 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Perera, R. & Zoncu, R. Das Lysosom als regulatorisches Zentrum. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 32, 223–253 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Z. et al. Rolle von Lysosomen bei physiologischen Aktivitäten, Krankheiten und Therapie. J. Hämatol. Oncol. 14, 79 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Bonam, S., Wang, F. & Muller, S. Lysosomen als therapeutisches Ziel. Nat. Rev. Drug Discov. 18, 923–948 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adra, CN et al. LAPTM5: ein neuartiges lysosomal-assoziiertes Multispanning-Membranprotein, das bevorzugt in hämatopoetischen Zellen exprimiert wird. Genomics 35, 328–337 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ouchida, R. et al. Ein lysosomales Protein reguliert die Expression des Oberflächen-T-Zell-Antigenrezeptors negativ, indem es den Abbau der CD3zeta-Kette fördert. Immunität 29, 33–43 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kawai, Y. et al. LAPTM5 fördert den lysosomalen Abbau von intrazellulärem CD3ζ, jedoch nicht von CD3ζ auf der Zelloberfläche. Immunol. Zellbiol. 92, 527–534 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Glowacka, WK, Alberts, P., Ouchida, R., Wang, JY & Rotin, D. Das LAPTM5-Protein ist ein positiver Regulator proinflammatorischer Signalwege in Makrophagen. J. Biol. Chem. 287, 27691–27702 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gao, L. et al. Das Lysosomal-assoziierte Protein Transmembran 5 fungiert als neuartiger negativer Regulator der pathologischen Herzhypertrophie. Vorderseite. Herz-Kreislauf. Med. 8, 740526 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ye, P. et al. Phosphatase 26 mit doppelter Spezifität schützt vor nichtalkoholischer Fettlebererkrankung bei Mäusen durch Unterdrückung der Beta-aktivierten Kinase 1 des transformierenden Wachstumsfaktors. Hepatology 69, 1946–1964 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ye, P. et al. Dual-spezifische Phosphatase 9 schützt vor nichtalkoholischer Fettlebererkrankung bei Mäusen durch ASK1-Unterdrückung. Hepatologie 69, 76–93 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, L. et al. Das dreiteilige Motiv 16 lindert nichtalkoholische Steatohepatitis, indem es den Abbau von Phospho-TAK1 fördert. Zellmetabolismus 33, 1372–1388.e1377 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Win, S. et al. Die Deletion oder der Abbau von mitochondrialen SABs in der Leber lindert das ernährungsbedingte metabolische Syndrom, Steatohepatitis und Leberfibrose. Hepatologie 74, 3127–3145 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Manso, AM et al. Die systemische AAV9.LAMP2B-Injektion kehrt die metabolische und physiologische Multiorgan-Dysfunktion in einem Mausmodell der Danon-Krankheit um. Wissenschaft. Übers. Med. 12, eaax1744 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sudhakar, JN et al. Die lumenale Galectin-9-Lamp2-Interaktion reguliert Lysosome und Autophagie, um die Pathogenese im Darm und in der Bauchspeicheldrüse zu verhindern. Nat. Komm. 11, 1–17 (2020).

Artikel Google Scholar

Gu, S. et al. Die Herunterregulierung von LAPTM4B trägt zur Beeinträchtigung des autophagischen Flusses durch ungehinderte Aktivierung der mTORC1-Signalübertragung während einer myokardialen Ischämie/Reperfusionsverletzung bei. Zirkel. Res. 127, e148–e165 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nedelsky, N., Todd, P. & Taylor, J. Autophagie und das Ubiquitin-Proteasom-System: Mitarbeiter bei der Neuroprotektion. Biochim. Biophys. Acta 1782, 691–699 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, Y., Wang, P., Wang, F., Lin, H. & Huang, Y. miR-29a moduliert GSK3β/SIRT1-verknüpften mitochondrialen proteostatischen Stress, um die nichtalkoholische Steatohepatitis bei Mäusen zu lindern. Int. J. Mol. Wissenschaft. 21, 6884 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sharma, M., Urano, F. & Jaeschke, A. Cdc42 und Rac1 tragen maßgeblich zum durch gesättigte Fettsäuren stimulierten JNK-Signalweg in Hepatozyten bei. J. Hepatol. 56, 192–198 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pak, Y., Glowacka, WK, Bruce, MC, Pham, N. & Rotin, D. Der Transport von LAPTM5 zu Lysosomen erfordert die Assoziation mit der Ubiquitin-Ligase Nedd4, nicht jedoch die Ubiquitinierung von LAPTM5. J. Cell Biol. 175, 631–645 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Takaya, I., Jun, I., Ken-ichi, K., Issei, I. & Johji, I. Die Ubiquitinligase ITCH vom HECT-Typ zielt auf das lysosomal-assoziierte Protein Multispanning Transmembrane 5 (LAPTM5) ab und verhindert den durch LAPTM5 vermittelten Zelltod . J. Biol. Chem. 286, 44086–44094 (2011).

Artikel Google Scholar

Caligiuri, A., Gentilini, A. & Marra, F. Molekulare Pathogenese von NASH. Int. J. Mol. Wissenschaft. Rev. 17, 1575 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Harmeet, M. Freie Fettsäuren induzieren JNK-abhängige Hepatozyten-Lipoapoptose. J. Biol. Chem. 281, 12093–12101 (2006). F, BS., W, WN. & J, GG.

Artikel Google Scholar

Yuren, W. Hepatospezifische Wirkungen von Fructose auf die c-jun NH2-terminale Kinase: Auswirkungen auf die hepatische Insulinresistenz. Bin. J. Physiol. Endokrinol. Metab. 287, E926–E933 (2004). & J, PM.

Artikel Google Scholar

G, P. et al. Mitogen-aktivierte Protein (MAP)-Kinasewege: Regulierung und physiologische Funktionen. Endokr. Rev. 22, 153–183 (2001).

Google Scholar

Chen, L. et al. Die Herunterregulierung von LAPTM5 unterdrückt die Zellproliferation und die Lebensfähigkeit und führt zum Stillstand des Zellzyklus in der G0/G1-Phase von Blasenkrebszellen. Int. J. Oncol. 50, 263–271 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cheng, TL, Symons, M. & Jou, TS Regulierung von Anoikis durch Cdc42 und Rac1. Exp. Zellauflösung 295, 497–511 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ouchida, R., Kurosaki, T. & Wang, JY Eine Rolle des lysosomal-assoziierten Proteins Transmembran 5 bei der negativen Regulierung der Oberflächen-B-Zell-Rezeptorspiegel und der B-Zell-Aktivierung. J. Immunol. 185, 294–301 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jiang, B. et al. Das lysosomale Protein Transmembran 5 fördert die lungenspezifische Metastasierung, indem es den lysosomalen Abbau von BMPR1A reguliert. Nat. Komm. 13, 4141 (2022).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, L. et al. Vpr wirkt der Einschränkung von LAPTM5 entgegen und fördert die HIV-1-Infektion in Makrophagen. Nat. Komm. 12, 3691 (2021).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, GN et al. Tmbim1 ist ein multivesikulärer Körperregulator, der vor nichtalkoholischen Fettlebererkrankungen bei Mäusen und Affen schützt, indem er auf den lysosomalen Abbau von Tlr4 abzielt. Nat. Med. 23, 742–752 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

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Wir danken Dr. Hao Zhang (Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology) und Shan-Shan Chen (Central Hospital of Wuhan, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology) für ihre technische Unterstützung und geistige Ermutigung . Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Fundamental Research Funds for the Central Universities (HUST Nr. 2021GCRC037) und der National Natural Science Foundation of China (81730015, 82170504, 81974048) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Lang Jiang, Jing Zhao, Qin Yang, Mei Li.

Abteilung für Herz-Kreislauf-Chirurgie, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 430022, Wuhan, China

Lang Jiang, Hao Liu, Xiaoyue Xiao, Peiwen Yang und Jiahong Xia

Abteilung für Kardiologie, Zentralkrankenhaus von Wuhan, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 430014, Wuhan, China

Jing Zhao, Manhua Chen und Ping Ye

Abteilung für Kardiologie, Zentralkrankenhaus Huanggang, 438021, Huanggang, China

Qin Yang

School of Basic Medical Science, Universität Wuhan, 430071, Wuhan, China

Mei Li, Song Tian und Sha Hu

Abteilung für Kardiologie, Renmin-Krankenhaus der Wuhan-Universität, 430060, Wuhan, China

Zhen Liu

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P.Ye. und JX entwarf die Experimente. LJ, JZ, QY und ML führten die Experimente und Datenanalysen durch und verfassten das Manuskript. ST, SH und ZL führten eine bioinformatische Analyse durch. HL, XX und P.Yang. technische Unterstützung geleistet. MC gab Ratschläge und Kommentare. P.Ye., MC und JX organisierten und überwachten die Studie.

Korrespondenz mit Manhua Chen, Ping Ye oder Jiahong Xia.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Pablo Muriel und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Jiang, L., Zhao, J., Yang, Q. et al. Lysosomal-assoziiertes Protein Transmembran 5 lindert nichtalkoholische Steatohepatitis, indem es den Abbau von CDC42 bei Mäusen fördert. Nat Commun 14, 2654 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37908-9

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Eingegangen: 14. September 2022

Angenommen: 05. April 2023

Veröffentlicht: 08. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37908-9

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