ASMS sieht Einführung eines neuen Höchststands

May 05, 2023

NEW YORK – Auf der Jahreskonferenz der American Society for Mass Spectrometry diese Woche in Houston stellten Thermo Fisher Scientific und Bruker beide Instrumente vor, die die Leistung proteomischer Analysen erheblich steigern könnten.

Die beiden Instrumente bieten Verbesserungen sowohl beim Durchsatz als auch bei der Abdeckungstiefe und sollten Herausforderungen in einer Reihe von Proteomikanwendungen bewältigen, einschließlich besonders heißer Forschungsbereiche wie Einzelzell- und Plasma-basierte Experimente.

Brukers neues timsTOF Ultra-Massenspektrometer ist die neueste Ausgabe seiner timsTOF-Instrumentenreihe. Diese Instrumente wurden seit ihrer Einführung im Jahr 2016 von Proteomikforschern stark angenommen und stellten eine große Herausforderung für die Orbitrap-Technologie von Thermo Fisher dar, die den Markt über weite Strecken des vorangegangenen Jahrzehnts dominiert hatte.

Karl Mechtler, Leiter der Proteomik am Wiener Forschungsinstitut für Molekulare Pathologie, sagte, das neue Instrument bringe Aspekte von Brukers bestehendem timsTOF SCP, das für die Analyse einzelner Zellen und anderer kleinvolumiger Proben gedacht ist, und seines zielgerichteteren timsTOF HT zusammen bis hin zu tiefen proteomischen Hochdurchsatzanalysen von Massenproben, einschließlich Plasma.

Der Ultra verbessere die Fähigkeiten des SCP zur Analyse kleiner Proben und ermögliche gleichzeitig eine Hochleistungsanalyse größerer Proben, sagte Mechtler, obwohl er vermutete, dass für besonders komplizierte Proben wie Plasma das timsTOF HT wahrscheinlich immer noch das bessere Instrument sei.

Auf dem ASMS-Treffen in dieser Woche hob Bruker insbesondere die Kapazität des Ultra für die Einzelzell-Proteomik hervor und wies in Pressematerialien darauf hin, dass das Instrument etwa 5.000 Proteine ​​auf Einzelzellebene identifizieren und mehr als 4.800 Proteine ​​bei Variationskoeffizienten von unter quantifizieren kann 20 Prozent.

Mechtler präsentierte diese Woche auf Brukers Benutzertreffen Daten, die sein Labor mit dem Ultra-Instrument generiert hatte. Auf dem Ultra konnten er und seine Kollegen etwa 6.000 Proteingruppen mit einem mittleren Variationskoeffizienten von 10 Prozent in einem 250-Pikogramm-Standard (entspricht etwa der Proteinmenge in einer einzelnen Zelle) messen, verglichen mit etwa 5.000 Proteinen mit einem mittlerer CV von 12 Prozent unter Verwendung des SCP. Sein Labor untersuchte tatsächlich einzelne HeLa- und K562-Zellen (im Gegensatz zu Standards) und identifizierte mit dem Ultra 3.803 bzw. 3.221 Proteine.

Während Brukers Ultra ein Update einer bestehenden Plattform ist, markiert die neue Version von Thermo Fisher, der Orbitrap Astral MS, die Einführung einer neuen Technologie, des Astral-Analysators (für asymmetrische Spurverlustfreiheit) des Unternehmens. Ähnlich wie ein Flugzeitanalysator (TOF) misst der Astral die Bewegung von Ionen entlang einer Spur innerhalb des Instruments und ihre Ankunft an der Oberfläche eines Detektors. Nach Angaben des Unternehmens erreicht der Astral jedoch eine deutlich bessere Ionenübertragung als ein typisches TOF-Instrument, da mehr als 80 Prozent der Ionen den Detektor erreichen. Das System nutzt asymmetrische Ionenspiegel, um eine offene elektrostatische Falle zu bilden und so eine 30 Meter lange Bahn zu schaffen, auf der die Ionen entlanglaufen können.

Das Instrument umfasst außerdem einen Quadrupol-Upfront- und einen Orbitrap-Analysator. Der Astral-Analysator bietet eine Scanrate von bis zu 200 Hz und eine Auflösung von 80.000, während der Orbitrap Scanraten von bis zu 40 Hz und eine Auflösung von bis zu 480.000 bietet. Die Biopharma-Option des Orbitrap ermöglicht die Analyse von Molekülen mit bis zu m/z 8.000.

Orbitraps bieten eine deutlich höhere Auflösung als TOF-Analysatoren. TOFs bieten jedoch viel höhere Scangeschwindigkeiten, und in den letzten Jahren sind viele Proteomikforscher auf diese schnelleren Instrumente umgestiegen. Wie Ben Orsburn, ein Proteomikforscher in der Abteilung für Pharmakologie und Molekularwissenschaften der Johns Hopkins University und ehemaliger leitender Feldanwendungswissenschaftler in der Proteomik bei Thermo Fisher, letztes Jahr gegenüber GenomeWeb sagte, ist die hohe Geschwindigkeit von TOF-Instrumenten wie Brukers timsTOF und Sciex‘ ZenoTOF ausschlaggebend Es fiel ihm schwer, zu den langsameren Instrumenten auf Orbitrap-Basis zurückzukehren.

Mit seiner Scanrate von 200 Hz dürfte der Astral Thermo Fisher dabei helfen, diese Geschwindigkeitslücke zu schließen. Im Vergleich dazu bietet der ZenoTOF eine Höchstgeschwindigkeit von 133 Hz, während Brukers timsTOF HT, das frühere Spitzengerät des Unternehmens, eine Höchstgeschwindigkeit von 150 Hz hat. Brukers neues Ultra-Instrument hingegen erreicht eine Spitzenfrequenz von 300 Hz.

Diese Geschwindigkeit wird sich für datenunabhängige Erfassungsworkflows (DIA) als nützlich erweisen, was laut Bradley Hart, Senior Director of Analytical Sciences Marketing und Life Sciences Mass Spectrometry Product Marketing bei Thermo Fisher, ein neuer Schwerpunkt für das Unternehmen ist.

Während Thermo Fisher seit langem DIA-Workflows für den Einsatz auf seinen Orbitrap-basierten Instrumenten entwickelt und anbietet, investiert Hart nach eigenen Angaben traditionell mehr Ressourcen in Workflows mit datenabhängiger Erfassung und Tandem-Massen-Tag-Kennzeichnung.

Dies, so sagte er, habe dazu geführt, dass das Unternehmen mit einigen seiner Kunden und dem Proteomik-Bereich im Allgemeinen etwas aus dem Takt geraten sei, da DIA-Workflows immer beliebter würden.

„Das war unser Fehler“, sagte Hart über das Versäumnis von Thermo Fisher, DIA-Arbeitsabläufe zu priorisieren. „Wir haben irgendwie geglaubt, dass DIA einige Herausforderungen mit sich bringt, vielleicht war es nicht reproduzierbar, die Zahlen waren bei den IDs allgegenwärtig und quantitativ war es fraglich. Aber ich denke, unsere Kunden haben uns in vielen Fällen das Gegenteil bewiesen.“ Von Wegen."

Diese Erkenntnis habe das Unternehmen dazu veranlasst, sein DIA-Angebot neu zu gestalten, sagte Hart und hob ein neues DIA-Setup hervor, das sein Vanquish NEO UHPLC-System, µPAC NEO HPLC-Säulen, EASY-Spray Nano Source und die Proteome Discoverer-Software mit dem Chimerys-Suchalgorithmus kombiniert. Dieses Setup ist nicht spezifisch für den Orbitrap Astral, aber das Instrument zeigt eine starke Leistung, wenn es für DIA-Workflows verwendet wird. Laut Thermo Fisher ist es in der Lage, DIA-Experimente mit 13,4-minütigen LC-Gradienten (100 Proben pro Tag) durchzuführen, die mehr als 8.500 Proteine ​​im HeLa-Zelllysat messen.

Joshua Coon, Professor für biomolekulare Chemie und Chemie an der University of Wisconsin-Madison und ein Early-Access-Benutzer des Orbitrap Astral, sagte, dass sein Labor mit dem Instrument innerhalb von acht Minuten 8.000 Proteine ​​in Zelllinien und Gehirnzellproben gemessen habe LC-Gradient. In einem anderen Experiment teilte das Labor diese Proben in acht Fraktionen auf, die jeweils mit einem achtminütigen Gradienten durchgeführt wurden, und maß 12.000 Proteine ​​in etwas mehr als einer Stunde.

„Das ist meiner Meinung nach ziemlich bemerkenswert“, sagte Coon. „Das heißt, wenn man groß angelegte Studien durchführen möchte, öffnet sich wirklich die Tür, um den Durchsatz zu erreichen, den man braucht. Wir sind [beim Durchsatz] besser geworden, aber das ist ein spürbarer Fortschritt.“

Jennifer Van Eyk, Direktorin der Precision Biomarker Laboratories des Cedars-Sinai Medical Center, nutzt den Orbitrap Astral für Plasma-Proteomanalysen, wo er offenbar auch eine erhebliche Leistungssteigerung gegenüber bereits vorhandenen Instrumenten bietet. Van Eyk sagte, dass das neue Instrument bei Experimenten mit 60 Proben pro Tag in nicht erschöpftem Plasma in der Lage sei, zwei- bis 2,5-mal so viele Proteine ​​zu messen wie mit dem gleichen Arbeitsablauf auf dem 480 Exploris-Instrument von Thermo Fisher.

„Wir ziehen nicht nur mehr Proteine ​​heraus, sondern auch mehr quantifizierbare Proteine ​​und Proteine, die wiederholbar sind. Das heißt, wenn wir [eine Probe] fünfmal testen, sehen wir auch alles fünfmal“, sagte sie. „Es ist ein großer Sprung.“

Am beeindruckendsten sei vielleicht der Durchsatz, den das Instrument ermöglicht, sagte Van Eyk und stellte fest, dass sie und ihre Kollegen gute Daten und eine umfassende Abdeckung erhalten haben, indem sie bis zu 180 nicht erschöpfte Plasmaproben pro Tag analysierten.

„Bei 180 Proben [pro Tag] kann man plötzlich davon sprechen, 10.000 Proben durchzuführen, und dann wird daraus eine Bevölkerungsstudie“, sagte sie.

„Wir glauben, dass dieses Instrument das Potenzial hat, echte Hochdurchsatzstudien mit großen Kohorten für die Proteomik zu ermöglichen und endlich wirklich zur Präzisionsmedizin und personalisierten Medizin zu gelangen“, sagte Hart. Er sagte, dass das Unternehmen in seiner internen Arbeit gezeigt habe, dass das Instrument etwa 600 Proteine ​​in nicht abgereicherten, unfraktionierten Plasmaproben messen könne, wenn es mit einer Rate von 180 Proben pro Tag betrieben werde.

Durch die Fraktionierung und Anreicherung von Plasmaproben kann das Instrument viel tiefer gehen. Hart sagte, dass der Orbitrap Astral mit der Proteograph-Plattform von Seer, die Nanopartikel zur Anreicherung von Plasmaproben für proteomische Analysen verwendet, in der Lage ist, etwa 6.000 Proteine ​​im Plasma mit einem Durchsatz von vier Proben pro Tag zu messen. Dieser Durchsatz dürfte mit der kürzlichen Veröffentlichung der neuen Version seines Proteograph-Assay-Kits, dem Proteograph XT, von Seer steigen. Während das Original-Kit erforderte, dass Benutzer ihre Proben in fünf Fraktionen aufteilen mussten, was bedeutete, dass jede Probe fünf separate LC-MS-Läufe erforderte, erfordert das XT nur zwei Fraktionen, was bedeutet, dass jede Probe nur zwei separate LC-MS-Läufe erfordert. In Daten, die Thermo Fisher diese Woche auf der ASMS zeigte, konnte der Orbitrap Astral mit dem neuen XT-Kit etwa 6.000 Proteine ​​in etwa 30 Plasmaproben pro Tag messen.

Coon, der die Proteograph-Plattform von Seer nutzt, sie aber noch nicht mit dem Orbitrap Astral verwendet hat, verwies auch auf die starke Leistung des Instruments im Plasma und wies darauf hin, dass sein Labor in der Lage war, etwa 1.500 Proteine ​​in nicht erschöpftem, nicht angereichertem Plasma mit einem 50-m-Gerät zu messen. Er hatte einen winzigen LC-Gradienten entwickelt und eine einminütige Direktinfusionsmethode auf dem Instrument entwickelt, mit der etwa 200 Proteine ​​pro Probe gemessen werden können.

Coon sagte, dass „Massenspezifizierungsstarts oft zu echten, aber bescheidenen Steigerungen führen“, er den Orbitrap Astral jedoch als einen dramatischeren Fortschritt ansehe. „Ich denke, es ist eine große Sache.“

Die mit dem Orbitrap Astral erzeugten Plasma-Proteomdaten „sind wirklich spektakulär“, sagte Mechtler, obwohl er anmerkte, dass es abzuwarten bleibt, wie gut sie sich halten, wenn das Instrument breiter eingesetzt wird. Er sagte auch, dass die Daten, die er für Einzelzellexperimente gesehen habe, darauf hinwiesen, dass das Ultra in dieser Hinsicht das leistungsstärkere System sei und eine reproduzierbare Quantifizierung für eine größere Anzahl von Proteinen biete.

„Die beiden Maschinen sind beide wirklich spektakulär“, sagte Mechtler. „Ich würde nicht sagen: ‚Kaufen Sie diese Maschine oder kaufen Sie diese Maschine‘.“ Beide sind wirklich großartig.