Molekulare und biochemische Charakterisierung von Reis, entwickelt durch konventionelle Integration von nDart1

May 16, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8139 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mutationen, also genetische Variationen in Genomsequenzen, spielen in der Molekularbiologie und Biotechnologie eine wichtige Rolle. Bei der DNA-Replikation oder Meiose handelt es sich bei einer der Mutationen um Transposons oder springende Gene. Ein einheimisches Transposon nDart1-0 wurde durch konventionelle Züchtungstechnik und sukzessive Rückkreuzung erfolgreich in die lokale Indica-Sorte Basmati-370 aus der Transposon-markierten Linie GR-7895 (Japonica-Genotyp) eingeführt. Pflanzen aus segregierenden Populationen, die vielfältige Phänotypen aufwiesen, wurden als BM-37-Mutanten markiert. Eine Explosionsanalyse der Sequenzdaten ergab, dass das GTP-bindende Protein, das sich auf dem BAC-Klon OJ1781_H11 von Chromosom 5 befindet, eine Insertion des DNA-Transposons nDart1-0 enthielt. Der nDart1-0 hat „A“ an Position 254 bp, während nDart1-Homologe ein „G“ haben, was nDart1-0 effizient von seinen Homologen unterscheidet. Die histologische Analyse ergab, dass der Chloroplast der Mesophyllzellen in BM-37 durch eine Verringerung der Größe der Stärkekörner und eine höhere Anzahl osmophiler Plastoglobuli zerstört wurde, was zu einem verringerten Chlorophyllgehalt und verringerten Carotinoiden sowie Gasaustauschparametern (Pn, g, E, Ci) führte ) und verringertes Expressionsniveau von Genen, die mit der Chlorophyll-Biosynthese, der Photosynthese und der Chloroplastenentwicklung verbunden sind. Zusammen mit dem Anstieg des GTP-Proteins stiegen die Gehalte an Salicylsäure (SA) und Gibberellinsäure (GA) sowie der Gehalt an Antioxidantien (SOD) und MDA deutlich an, während die Zytokinine (CK), Ascorbatperoxidase (APX) und Katalase (CAT) deutlich anstiegen. Der Gesamtflavanoidgehalt (TFC) und der Gesamtphenolgehalt (TPC) waren in BM-37-Mutantenpflanzen im Vergleich zu WT-Pflanzen deutlich verringert. Diese Ergebnisse stützen die Annahme, dass GTP-bindende Proteine ​​den Prozess beeinflussen, der der Chloroplastenbildung zugrunde liegt. Daher wird davon ausgegangen, dass die mit nDart1-0 markierte Mutante (BM-37) von Basmati-370 zur Bekämpfung biotischer oder abiotischer Stressbedingungen von Nutzen sein könnte.

Reis ist eine einkeimblättrige, semi-aquatische einjährige Graspflanze und gehört zur Familie der Poaceae und zur Gattung Oryza1. Die Gattung Oryza umfasst 22 wildlebende Taxa, von denen zwei Arten für den menschlichen Verzehr von großer Bedeutung sind2. Bei diesen Arten handelt es sich um Oryza sativa L., allgemein bekannt als asiatischer Reis, und Oryza glaberrima Steud, allgemein bekannt als afrikanischer Reis. Mehrere Klassifikationen innerhalb der Gattung Oryza umfassen Oryza officinalis, Oryza ridelyi und Oryza rufipogon. Von den 22 wilden Oryza-Arten stammen 15 aus Asien und 7 aus Afrika südlich der Sahara3. Diese Arten sind in interspezifischen Reiszuchtprogrammen von Vorteil, da wilde Oryza-Arten besondere Merkmale aufweisen, einschließlich abiotischer und biotischer Stresstoleranz4,5. Über die Hälfte aller Menschen isst Reis und ist damit die wichtigste Getreidepflanze6.

Darüber hinaus wurde die vollständige Genomsequenz von Reis mit großer Genauigkeit sequenziert und es wurden vergleichsweise viele Transposons gefunden, was es zu einem hervorragenden Modell für die Untersuchung von Transposons macht7,8. Ein nDart1-0-Transposon (pyl-v) wurde in einer vireszenten Reismutante mit hellgelben, bunten Blättern von Taichung-65 (Oryza sativa japonica L.)9 gefunden. Insbesondere Genotypen, die aDart1-27, ein aktives autonomes DNA-Element, enthalten, tragen ein Transposon-Gen, das Element nDart1 wird aktiv im gesamten Genom übertragen10. Die nDart1-Elemente, die zur Superfamilie hAT gehören, werden aus chromosomalen Insertionsstellen herausgeschnitten und an andere Stellen transponiert, obwohl sie einen hohen Grad an Sequenzähnlichkeit aufweisen, nDart1-0 und die eng vergleichbaren nicht autonomen Komponenten nDart1-1 bis nDart1-12 unterschiedliche Transpositionsfrequenzen anzeigen11. Aktive Transposons werden häufig verwendet, um Gene zu markieren und ihre Funktionalitäten offenzulegen12,13. Eine Tagging-Methode ist ein wirksames Werkzeug, da nDart1-Elemente aktiv in das Genom transponiert werden und dazu neigen, sich an genomischen Stellen zu integrieren. Die nDart1-Elemente werden insbesondere an Stellen am proximalen Promotor des Genoms transponiert, die 0,5 kb vor den mutmaßlichen Initiationscodons liegen14. Die iPCR-basierten Methoden und Transposon-Display (TD)-Methoden wurden ebenfalls entwickelt, um eingefügte Stellen von nDart1 im Genom effizient zu lokalisieren15,16.

Sowohl bei der Japonica- als auch bei der Indica-Unterart des Reises wurde das gesamte Genom sequenziert, die experimentelle Forschung zu vielen funktionellen Genen im Reisgenom ist jedoch noch im Gange17. Zu untersuchen, wie viele Gene funktionieren, ist heute eines der schwierigsten Ziele. Den Beschreibungen bestimmter spezifischer Gene zufolge sind zahlreiche Zwischenkomponenten von Entwicklungsprozessen, nämlich Proteine, die an Signaltransduktionswegen beteiligt sind, noch weitgehend konserviert. Das G-Protein ist ein fantastisches Beispiel für diese sogenannten molekularen Schalter18. Durch intrinsische Aktivitäten unterliegen diese Proteine ​​Konformationsänderungen, die durch die Bindung und Hydrolyse von GTP14 hervorgerufen werden. GTP-bindende Proteine ​​unterscheiden sich bei Eukaryoten und Prokaryoten und gehören zu den wichtigsten Proteinen für alle Arten19. GTPasen oder G-Proteine ​​sind andere Namen für diese Proteine. Es handelt sich um einen molekularen Schalter, der in allen Lebensbereichen vorhanden ist. Es wird durch das GTP-Molekül „aktiviert“ und durch die Hydrolyse des GTP-Moleküls zu GDP „inaktiviert“. Es reguliert mehrere zelluläre Funktionen, einschließlich der Neuordnung des Zellzytoskeletts, der Signaltransduktion, der Translation, der Transkriptionsregulation, des Vesikelhandels und des Proteintransports20,21. Die G1-, G2-, G3-, G4- und G5-Motive sind in allen G-Proteinen vorhanden. Diese Substanzen sind für die GTP-Hydrolyse, die GTP-Konformationsänderung und die GDP/GTP-Umwandlung notwendig. In der G-Protein-Familie bleibt das G2-Muster stabil erhalten, hat jedoch nur geringe Auswirkungen auf die GDP/GTP-Austauschaktivität22,23. Ziel dieser Studie war es, das Transposon nDart1-0 in die stark wachsende lokale Indica-Reissorte „Basmati-370“ einzuführen, um durch konventionelle Züchtung eine Mutante zu erhalten und das ERA-ähnliche GTP-bindende Protein-Gen und seine Auswirkungen auf die Aktivierung zu charakterisieren Phytohormone, die hilfreich sein können, um bei Reis eine Toleranz gegenüber biotischem/abiotischem Stress zu induzieren.

Das für das aktuelle Experiment benötigte Zuchtmaterial wurde aus zwei verschiedenen Quellen gesammelt; Samen der Indica-Reissorte Basmati-370 vom Rice Research Institute, Kala Shah Kaku, Punjab, Pakistan, und Samen der Japonica-Linie GR-7895 (bestehend aus nDart1-0-Transposon) vom Plant Genetic Resources Institute, National Agricultural Research Center (NARC) , Islamabad, Pakistan. Es wurde bestätigt, dass die experimentelle Datenerfassung den relevanten institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien und Gesetzen mit entsprechenden Genehmigungen des Plant Genetic Resources Institute, National Agricultural Research Center (NARC), Islamabad, Pakistan, entsprach. Die Daten zu Suchexperimenten, die im Rahmen der Studien zu Basmati-370 enthüllt wurden, haben gezeigt, dass es keines der aDart-Elemente enthält. Der aDart ist eigentlich ein Träger für das nDart1-0-Transposonelement. Zu Studienzwecken wurden Mutanten für die Genmarkierung durch Einfügen des Transposon-aDart-Elements entwickelt. Es wurde eine Kreuzung zwischen Basmati-370 und GR-7895 durchgeführt, um ein Dart-Element in Basmati-370 aus dem GR-7895-Genotyp einzufügen. Zu diesem Zweck wurden trockene reife Samen beider Linien oberflächensterilisiert und in kontrollierten Umgebungen in Töpfen aufgezogen. Um die Blüte für den Crossover zu synchronisieren, wurden Basmati-370-Samen vier aufeinanderfolgende Wochen lang in einwöchigen Abständen kultiviert. Die Kreuzung wurde durchgeführt, indem Basmati-370 als weibliches Elternteil gehalten wurde. Die F1-Samen wurden unter kontrollierten Bedingungen gezüchtet und mit bestimmten weiblichen Pflanzen von Basmati-370 rückgekreuzt, um BC1F1 zu produzieren. Diese Rückkreuzung wurde fortgesetzt, um BC4F1 zu erzeugen (Ergänzungsmaterial: Abb. S1). Die geernteten Samen von BC4F1 wurden gezüchtet und selbstbestäubt, um BC4F2 zu erhalten. Die Samen von BC4F2 wurden geerntet und unter kontrollierten Bedingungen weiter gezüchtet, um eine segregierende Population von Pflanzen bis BC4F4 zu erhalten und die für die Genmarkierung verwendeten abnormalen oder Albino-Phänotypen zu identifizieren.

Die DNA wurde aus den mutierten Pflanzen mithilfe eines von Doyle24 bereitgestellten Protokolls zur DNA-Isolierung extrahiert. Die extrahierte DNA wurde dann in Eppendorf transferiert; zusammen mit 7 μl RNAase, die 60 Minuten lang bei 37 °C inkubiert wurde. Die Qualität der DNA wurde mit 2 %igen Agarosegelen überprüft, während ihre Quantität mit Nanodrop gemessen wurde. Die Proben wurden dann für eine einheitliche und standardmäßige DNA-Konzentration auf bis zu 1 μl jeder Probe pro 50 μl dH2O verdünnt. Die isolierte DNA wurde dann quantifiziert, indem die Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen wurde, wobei dH2O als Blindprobe verwendet wurde.

RNA wurde aus Blättern von Reispflanzen von Basmati-370 (WT) und BM-37 (Mutante) mit dem TRIeasyTM Total RNA Extraction Reagent Kit (Yeasen Biotechnology Co., Ltd. Shanghai, China) gemäß den Richtlinien des Herstellers isoliert. Die Qualität der RNA wurde mit 2 %igen Agarosegelen überprüft, während ihre Quantität mit Nanodrop gemessen wurde. Die cDNA wurde durch eine verbesserte qRT-PCR-Technik aus der Gesamt-mRNA25,26 synthetisiert. Zur Amplifikation der Volllängen-cDNA von GTP wurde eine PCR unter Verwendung spezifischer Primer durchgeführt. Oligonukleotidprimer (Ergänzungsmaterial: Tabelle S1) für die Amplifikation der Volllängen-cDNA von OJ1781_H11 wurden basierend auf der angegebenen Sequenz in Reis (Zugangsnummer AC120986) entworfen. Die PCR-amplifizierte Sequenz wurde kloniert und sequenziert. Der Sequenzvergleich und die Datenanalyse wurden mithilfe von Blast mit der NCBI-Datenbank durchgeführt.

Wir untersuchten das Expressionsniveau von nDart1-0 in mutierten Basmati-370 (BM-37)-Pflanzen, einschließlich Plumules, drittem und fünftem Blatt im Keimlingsstadium, Wurzeln, Stängeln, Hülle, jungen Rispen und Fahnenblättern im Triebstadium Pflanzen. Es wurden quantitative RT-PCR-Tests durchgeführt, um die Menge der nDart1-Expression zu messen. Ein zusätzlicher Satz von Genen (PORA, CAO1, Cab1R, YGL1, CHLD, HEMA, PsbA, RNRS, RbcL, PsaA, RbcS, LhcpII, OsPoLP1, RNRL, FtsZ, Rpl21, RpoB, Rsp20, RpoA, OsRpoTp und Rps7 im Zusammenhang mit der Photosynthese , Chloroplastenentwicklung und Chlorophyllbiosynthese wurden durch qRT-PCR auf ihr Expressionsniveau untersucht. Für qRT-PCR entwickelte Primer sind in Tabelle S2 (Ergänzungsmaterial) aufgeführt. Die Bedingungen für Genamplifikationen sind in (Ergänzungsmaterial: Abb. S2) angegeben.

Die genomische DNA aus Blättern mutierter BM-37-Pflanzen wurde gemäß Dellaporta et al.27 isoliert. Alle Mutanten wurden mit der n1-0SPiPCR-Methode analysiert (Ergänzungsmaterial; Datei 1). Für die PCR wurden folgende Bedingungen angepasst: eine Aktivierungsphase bei 95 °C für 30 s, Denaturierung mit 35 Zyklen bei 60 °C für 30 s, Annealing bei 72 °C für 60 s und Extension bei 72 °C für 10 min. Durch die Entwicklung von Primern mithilfe der Softwareanwendung Primer_premier5 aus dem flankierenden Bereich des Gens um die Insertionsstelle des Transposons wurden die Transposonfragmente amplifiziert.

Die Blattproben von Basmati-370- (WT) und mutierten (BM-37) Pflanzen ohne Adern wurden zufällig ausgewählten Sämlingen entnommen und 5 Stunden lang in 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 7,0 gegeben und dann dreimal mit gewaschen Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0). Darüber hinaus wurden die Proben 1 Stunde lang mit 1 % OsO4 nachfixiert und bei jedem Waschgang dreimal mit Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0) 15 Minuten lang gewaschen. Anschließend wurden die Proben mit einer abgestuften Reihe von Ethanol (30, 50, 70, 80, 90 bzw. 100 %) dehydriert und 20 Minuten lang mit konzentriertem Aceton übergossen und schließlich in Spurr-Medium eingebettet, bevor sie in ultradünne Abschnitte geschnitten wurden. Darüber hinaus wurden die Proben nach dem Schneiden in ultradünne Abschnitte zur Beobachtung unter dem Transmissionselektronenmikroskop (JEOLTEM-1230EX) auf die Kupfernetze gelegt.

Mithilfe eines Spektrophotometers und geringfügiger Anpassungen der Methoden von Arnon und Wellburn28,29 wurden Carotinoid (Car), Gesamtchlorophyll und Chlorophyll (a und b) bestimmt. Kurz gesagt wurden 0,2-g-Proben von Blättern von Sämlingen, die unter kontrollierten Bedingungen im Dreiblattstadium gezüchtet wurden, gesammelt und 18 Stunden lang im Dunkeln in 5 ml Ethanol:Wasser:Aceton-Lösung (4:1:5) homogenisiert. Um übrig gebliebene Partikel zu entfernen, wurde Zentrifugation eingesetzt. Zur Auswertung der Überstände wurde ein UV5100-Spektrophotometer verwendet. Darüber hinaus wurde das tragbare Photosynthesesystem LI-6400 zur Quantifizierung der Transpirationsrate (E), der Konzentration von intrazellulärem CO2 (Ci), der stomatalen Leitfähigkeit (g) und der Netto-Photosyntheserate (Pn) verwendet.

Der Gesamtphenolgehalt wurde mit der Folin-Ciocalteu-Methode berechnet, wobei Gallussäure als kontrollierte Chemikalie fungierte30. Gallussäureäquivalente pro Gramm FW-Frischgewicht wurden verwendet, um die Menge der gesamten Phenolverbindungen anzugeben. Unter Verwendung von Catechin als Referenzbestandteil wurde die Aluminiumtrichlorid-Technik zur Messung der Flavonoidkonzentration eingesetzt31. (gE Catechin.100 g1 FW) wurde verwendet, um den gesamten Flavonoidgehalt auszudrücken. Den Empfehlungen des Herstellers folgend verwendeten wir ein pflanzliches ELISA-Kit zum Nachweis der endogenen Salicylsäure (SA), Abscisinsäure (ABA), Gibberellinsäure (GA) und Cytokinine (CK). Um die Konzentrationen von SA, ABA, GA und CK in den Proben zu messen, wurden Blätter in flüssigem Stickstoff pulverisiert. Die hormonellen SA-, ABA-, GA- und CK-ELISA-Kits werden mit einer Reihe von Kalibrierungsstandards geliefert. Anschließend wurden die SA-, ABA-, GA- und CK-Werte in den Proben gemessen, indem die Standardkurve angepasst und ein vergleichbarer Trend in den Proben erzeugt wurde.

Die Blattproben wurden in Natriumphosphatpuffer (pH 7,8) homogenisiert und 20 Minuten lang bei 4 °C und 13.000 U/min zentrifugiert. Dann wurde die Superoxiddismutase (SOD)-Aktivität spektrophotometrisch gemessen, wie von Zhang et al.32 beschrieben, bei 560 nm, indem die Fähigkeit jeder Einheit beurteilt wurde, die photochemische Reduktion von Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT) um 50 % zu hemmen. Die Peroxidase (POD)-Aktivität wurde nach Zhou und Leul33 bei 470 nm bestimmt und die mit Guajakol verbundenen Veränderungen wurden mit der Aktivitätskonstante (ε = 26,6 mm) normalisiert und die Katalase (CAT)-Aktivität wurde nach Aebi34 bestimmt. Die APX-Aktivität wurde in Abhängigkeit von der Abnahme der Absorption bei 290 nm nach Nakano und Asada35 berechnet, wenn Ascorbat oxidiert wurde. In dieser Studie wurden reaktive Sauerstoffspezies in Pflanzengeweben gemessen, darunter Wasserstoffperoxid (H2O2). Der Wasserstoffperoxidgehalt wurde wie von Velikova et al.36 beschrieben gemessen. Der Gehalt an Malondialdehyd (MDA) wurde nach Morales und Munné-Bosch bestimmt37. Der Gesamtphenolgehalt wurde mit der Folin-Cioalteu-Methode unter Verwendung von Gallussäure als Referenzverbindung gemessen30. Der Flavonoidgehalt wurde mit der Aluminiumtrichlorid-Methode unter Verwendung von Catechin als Referenzverbindung bestimmt38.

Für jeden Datensatz werden der Standardfehler und der Mittelwert aus drei Replikationen angegeben. Die Datenanalyse wurde mit Statistics 8.1, einem Statistiksoftwareprogramm, durchgeführt. Die aufgezeichneten Daten wurden durch Einwegvarianzanalyse und LSD-Test sowie Tukey-Test analysiert, um die paarweise Signifikanz bei p ˂ 0,05 zu bestimmen. Zur Erstellung der Diagramme wurde Origin Pro (Version 8.5) verwendet.

Zur Untersuchung der Genwirkung sind die Regulation und Charakterisierung von Genen aufgrund der Reverse- und Forward-Gene-Ansätze zum wichtigsten genetischen Werkzeug in der Biotechnologie und Gentechnik geworden. Zur Bewertung des genetischen Potenzials und der Variationen in der Population von Nutzpflanzen müssen Mutanten entwickelt werden, indem Bestrahlungen, Chemikalien, Transposons und induzierte genetische Mutationen zum Markieren von Genen eingesetzt werden, um funktionelle genomische Bewertungen von Artengenomen von enger bis umfassender durchzuführen Bereiche. In unserer aktuellen Studie haben wir ein aktives und nicht autonomes genomisches oder DNA-transponierbares Element in Reis beschrieben, das als nicht autonomes DNA-basiertes aktives Reistransposon eins (nDart1) bezeichnet wird. Das nDart1 ist ein ursächliches transponierbares Allelelement mit spontan veränderlicher und vireszenter Natur, das blassgelbe Blatt variegiert oder Pyl-V, das in der Regel in sehr frühen Sämlingsstadien blassgelbe mit dunkelgrünen Streifen auf den Blättern von Reispflanzen verursacht die Expression des nDart1-Gens in Reis. Es gibt mehrere Transposonelemente zusammen mit ihren mehreren Geninsertionsstellen, die in einer Kulturpflanzenlinie des Genotyps nur in begrenzter Anzahl gefunden wurden, da die Anforderungen für die Identifizierung und Charakterisierung spezifischer Gene, die ein Populationsgenom markieren, um eine maximale Sättigung transponierbarer Elemente zu erreichen, geringer sind . Für unsere aktuelle Studie haben wir das nDart1-Gen ausgewählt, um Reismutanten zu produzieren, die als blassgelbe, bunte Blätter exprimiert wurden. Das nDart1-Gen wurde durch die herkömmliche Rückkreuzungsmethode in die Sorte Basmit-370 eingefügt.

In unserer aktuellen Forschungsstudie haben wir ein endogenes und verfügbares Transposon namens nDart1 genutzt, um Mutanten für die Markierung von Genen im Reisgenotyp Basmati-370 zu entwickeln. Da wir in lokalen Basmati-Sorten keine aktiven nDarts oder aktiven Darts mit autonomen Elementen finden konnten, führten wir durch Rückkreuzung mutierter Gene den von Japonica abgeleiteten aDart und nDart1-0 in die Indica-Reissorte Basmati-370 ein. Verschiedene Pflanzen wurden aus segregierenden Populationen ausgewählt, die Variationen zeigten und als Mutanten (Abb. 1A) der BC4F4-Population markiert wurden. Durch genetische Analysen wurde vermutet, dass dieser Mutant durch ein Zweikomponenten-Transposonsystem kontrolliert wird.

Transposon-induzierte Mutanten aus sich trennender Population. (A) Phänotypischer Unterschied zwischen normalen, revertanten und stabilen Albino-Sämlingen; (C, D) phänotypisches Erscheinungsbild dritter Blätter im Sämlingsstadium von WT und BM-37-Mutante; (D) getrennte mutierte Pflanzen zur Markierung von Genen.

Während des Anbaus von Reispflanzen auf dem Feld nach BC4F4 gab es normale grüne Blätter im WT und bunte Arten von Albino-Reispflanzen in BM-37 (Abb. 1B, C), das mit nDart1/aDart1 eingeführt wurde. Es wurde postuliert, dass die Linien, die eine Genexpression zeigten, ein rezessives Allel hatten, das sowohl das homozygote nDart1-0 als auch ein aktives autonomes Element wie aDart1 mit heterozygoten Allelbedingungen aufwies. Es wurde festgestellt, dass die mutierte Linie stabile Albino-Nachkommen hervorbrachte (Abb. 1D). Die stabilen Mutanten zeigten, dass es nicht nur stabile homozygote GTP-Allele gab, sondern auch solche ohne ein aDart1-Element mit einem Verhältnis von 3:1 für F2. Es wurde auch festgestellt, dass es keinen Unterschied zwischen dem WT und den Mutanten bei Reissamen gab, aber der Unterschied wurde nur im Stadium des Sämlingswachstums festgestellt, wo die normalen Samen normale grüne Blätter und Stängel produzierten, während die mutierten Samen produzierten weiße Triebe und Blätter. Die Ergebnisse zeigten das Vorhandensein von aDart1-Elementen, die in den Phänotypen von Reispflanzen stabil waren. Es wurde festgestellt, dass aDart1-abhängige somatische nDart1-0-Exzisionen des Allels ein Blatt mit Variationen erzeugten, die sich über die gesamte Zelllinie oder Nachkommen mutierter Individuen der Reispflanze entwickelten. Allerdings können die weiß mutierten oder panaschierten Pflanzen unter extremen Bedingungen ihre Rispen mit fruchtbaren Körnern bilden.

Die Häufigkeit spontaner Mutationen unter natürlichen Wachstumsbedingungen ist äußerst gering. Transposons sind für die Genmarkierung und Funktionsanalyse nützlich, um natürliche Variationen zu erzeugen. Daher ist es nützlich, aktive Transposonquellen zu untersuchen. Mutantenphänotypen wurden im Feld markiert und DNA wurde aus phänotypisch bunten Blättern von Mutanten isoliert. Die DNA wurde einem Restriktionsverdau und einer Selbstligation unterzogen. Die Datensuche ergab, dass nDart1-0 dreizehn Homologe und eine hohe Homologie von über 99 % aufweist. An Position 254 bp hat nDart1-0 „A“, während die Homologen „G“ haben, wie in Tabelle S3 (Ergänzungsmaterial) gezeigt. Die Stelle „A“ wurde effizient genutzt, um nDart1-0 von seinen Homologen zu unterscheiden.

Dabei ist zu berücksichtigen, dass gemäß dieser Technik die DNA mit Alu I restringiert, selbstligiert und erneut einem Restriktionsverdau mit Bmt I und einer Amplifikation durch iPCR unter Verwendung spezifischer Primer unterzogen wird. Verdauung durch Alu I schränkt nDart1-0 an Position 254 ein, da es aufgrund der Substitution eines Basenpaars „A“ eine einzigartige spezifische Restriktionsstelle trägt, während Homologe während der Selbstligation an dieser Stelle „G“ tragen, dieses verdaute Fragment des nDart1-0 ligiert mit einem Fragment des von ihm befallenen Gens (Abb. 2). Durch Selbstligation entstehen einige spezifische Fragmente, die einen Teil von nDart1-0 und das von ihm befallene Gen zusammen mit anderen Fragmenten enthalten. Auch hier spaltet die Restriktion dieser selbstligierten DNA durch Bmt I nDart1-0, da es die Bmt I-Stelle trägt. Als Ergebnis erhalten wir ein Fragment des eingedrungenen Gens, das von nDart1-0 flankiert wird. Diese Fragmente wurden durch iPCR unter Verwendung der spezifischen Primer amplifiziert, die für die flankierende Region von nDart1-0 entwickelt wurden. Die beiden Runden oder Zyklen der iPCR (wie präselektive und selektive Genamplifikationen) wurden zur Bestätigung der Ergebnisse durchgeführt. Während der selektiven Art der Amplifikation wurde die weitere Verstärkung und Anreicherung von Transposon-Elementen oder ihren zugehörigen spezifischen Fragmenten durch die Verwendung verfügbarer PCR-Master-Mix-Produkte wie einer Vorlage erreicht, um die zweite Amplifikation transponierbarer Elemente mit dem verschachtelten Primertyp durchzuführen, der spezifisch erkannt wurde hochkonservierte transponierbare Elementregionen im Genom. Unspezifische genomische Umlagerungen während der iPCR sind aufgrund der von bestimmten Regionen des nDart1-0 abgeleiteten Primer ausgeschlossen. Andererseits tragen die nDart-Homologen keine Alu I-Stelle an Position 254, sie werden an dieser Position nicht verdaut und werden daher während der iPCR nicht mit spezifischen Primern amplifiziert (Ergänzungsmaterial: Abb. S3A). Wenn mit Alu I restriktive und selbstligierte DNA als Vorlage für iPCR verwendet wird, werden nDart1-0 und alle seine Homologen amplifiziert, aber diese Amplifikation ist auf nDart1-0 beschränkt, wenn selbstligierte DNA erneut mit Bmt I restriktiviert wird. Zur Bestätigung von Bei den erhaltenen Fragmenten handelte es sich entweder um transponierbare Elemente oder um nicht detektierte Transposonelementfragmente, die amplifiziert wurden, um die flankierenden Sequenzen des Transposonelements zu untersuchen. PCR-amplifizierte Fragmente wurden sequenziert und analysiert. Die Amplifikationsmuster für jedes Fragment waren ähnlich, dh flankiert von nDart1-0, mit Ausnahme des Unterschieds bei den befallenen Genen. Bisher haben wir 12 Genregionen entdeckt, in die nDart1-0 in der BM-37-Mutante eingedrungen ist (Ergänzungsmaterial: Tabelle S3). Es wurde festgestellt, dass es ein mutiertes amplifiziertes Fragment gab, das nDart1-0-flankierende Sequenzen enthielt, die aufgrund der Insertion von nDart1-0 in die ersten Exonregionen eines mutmaßlichen Gens abgeleitet wurden (Ergänzungsmaterial: Abb. S3B).

Das nDart1-0-Transposon und seine Homologen in Reis. Eine Sequenz des nDart1-0-Transposons in Reis. Pfeile zeigen Primerpositionen an. Pfeile und Restriktionsstellen zeigen Primerpositionen an, die rot hervorgehoben sind. TSD-Ziel-Site-Duplizierung; TIRs-terminale invertierte Wiederholungen.

Die Ergebnisse unserer Studie legen nahe, dass die Insertion des nDart1-0-Elements sowie dessen Ausschneiden in das mutmaßliche Gen als OJ1781_H11 auf Chromosom 5 erfolgten. Die Explosionsanalyse der Sequenzdaten ergab, dass sich der GTP-bindende Proteinort auf dem BAC-Klon OJ1781_H11 des Chromosoms befand Es wurde festgestellt, dass 5 eine Insertion des DNA-Transposons nDart1-0 enthielt. Dieses Gen hat eine Nukleotidsequenz von 2701 bp und 918 cDNA. Der ORF kodierte ein Polypeptid mit einer Sequenz von 305 Aminosäuren und umfasst 7 Exons, die durch 6 Introns unterbrochen sind. Bei der Genmarkierung wurden fünf Revertanten gefunden. Diese revertanten Phänotypen wurden analysiert, um die Abwesenheit oder Anwesenheit des Transposons herauszufinden. DNA wurde aus den Revertanten-Phänotypen isoliert und Transposon-inserierte Regionen wurden durch die bereits entworfenen Primer aus den flankierenden Regionen des Transposons amplifiziert. Amplifizierte Fragmente (Abb. 3A, B) wurden kloniert und sequenziert. Die Sequenzanalyse ergab, dass sich das Transposon von der Einfügungsstelle entfernte und dabei die Fußabdrücke hinterließ.

PCR-Amplifikation von nDart1-0-Mutanten und Transkripten des GTP-Bindungsprotein-Gens in mehreren Geweben von Basmati 370. (A) PCR-Amplifikation von nDart1-0-Mutanten. Spur 1: Basmati 370, Spur 2: T-65, Spur 3: Nipponbare, Spur 4: Veränderliches weißliches Blatt, Spur 5: Stabiles weißliches Blatt-1, Spur6: Stabiles weißliches Blatt-2, Spur7: Stabiles weißliches Blatt-3; (B) Transkripte des GTP-Bindungsprotein-Gens in mehreren Geweben von Basmati 370. Spur 1: Etioliertes Pflanzenblatt, Spur 2: Etiloiertes Pflanzenwurzel, Spur 3: 2 Wochen altes Pflanzenblatt, Spur 4: 2 Wochen alte Pflanzenwurzel , Spur 5: 2 Monate altes Pflanzenblatt, Spur 6: 2 Monate alte Pflanzenwurzel, Spur 7: 2 Monate alter Pflanzenstamm, Spur 8: 2 Monate altes Pflanzenmeristem, Spur 9: 2 Monate alte Pflanzenspelze, Spur 10: 2 Monate alt Pflanzenstaubbeutel, Spur11–2 Monate alte Pflanzennarbe.

Um das Expressionsmuster des Transposons nDart1-0 zu untersuchen, wurde die qRT-PCR auf mehreren Gewebeebenen (3. und 5. Blatt im Keimlingsstadium, Plumules, Hülle, Triebe, Wurzeln, junge Rispen und Fahnenblätter im Triebstadium) durchgeführt BM-37-Mutante. Die höchste Expression wurde in allen analysierten Geweben im dritten Blattstadium des Sämlings gefunden, verglichen mit dem fünften und dem Fahnenblatt, was darauf hindeutet, dass frühe Sämlingsblätter eine höhere Expression aufwiesen als andere Gewebe. Die Gewebe, einschließlich Stamm, Hülle und Wurzeln, zeigten ein deutlich geringeres Expressionsniveau als Blätter, während junge Rispen und Federn ein geringeres Expressionsniveau für BM-37 zeigten (Abb. 4). Die Ergebnisse legen nahe, dass nDart1-0 eine einflussreiche Rolle bei der Entwicklung der Blattchloroplasten spielt, insbesondere im frühen Keimlingsstadium.

Transkriptniveaus für die Expressionsstudie verschiedener Gewebe in der BM-37-Mutante. Plumules; 3. Drittel Blätter im Sämlingsstadium; 5.-5. Blätter im Sämlingsstadium; YR-junge Wurzeln; Stängel, Scheide, FL-Flaggenblätter und YP-junge Rispe. Alle Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von fünf Wiederholungen dar. Unterschiedliche Buchstaben über den Fehlerbalken weisen auf signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen bei p ≤ 0,05 hin.

Mittels TEM wurde der obere Teil der Blätter im Bestockungsstadium untersucht, um die ultrastrukturellen Veränderungen im Chloroplasten von WT- und BM-37-Mutantenpflanzen zu untersuchen. Im Gegensatz zu den BM-37-Chloroplasten, die gut entwickelte Lamellenstrukturen aufwiesen, waren die Grana-Lamellenstapel in WT-Pflanzen spärlich und dünn besiedelt. Dies deutet darauf hin, dass die BM-37-Mutation einen erheblichen Einfluss auf die Biogenese hatte. Das Ergebnis zeigte auch, dass Stärkekörnchen im Chloroplasten der BM-37-Mutante schwer zu lokalisieren waren (Abb. 5A, B), obwohl sie normalerweise im WT vorhanden waren. In der BM-37-Mutante gab es mehr osmophile Plastoglobuli (OP) als in der WT, was darauf hindeutet, dass der Chlorophyllstoffwechsel erheblich beeinträchtigt war.

TEM-Bilder von Chloroplasten in Pflanzen der WT- und BM-37-Mutante (A und B). G, Grana-Stapel; OP, osmophile Plastglobuli; SG, Stärkegranulat.

In der Keimlings- und Triebphase der WT- und BM-37-Pflanzen wurden die Carotinoid- und Chlorophyllgehalte untersucht, um den Einfluss des nDart1-0-Transposons auf den Photosynthese-Pigmentstoffwechsel festzustellen. Der Chlorophyllgehalt (a, b und a + b) und die Carotinoidspiegel waren bei BM-37 im Sämlingsstadium im Vergleich zu WT drastisch verringert; Der Chlorophyllgehalt und die Carotinoide zeigten jedoch im Kopfstadium sowohl bei WT- als auch bei BM-37-Mutantenpflanzen keine signifikanten Ergebnisse (Abb. 6A, B). Zusätzlich wurden die Gasaustauschparameter gemessen, um die photosynthetischen Eigenschaften von WT- und BM-37-Mutantenpflanzen zu vergleichen. Im Vergleich zum WT senkte die BM-37-Mutante die Geschwindigkeit der Photosyntheseaktivität (Pn), der stomatären Leitfähigkeit (g), der interzellulären CO2-Konzentration (Ci) und der Transpiration (E) drastisch (Abb. 6C–F).

Analyse des Chlorophyllpigmentgehalts, des Carotinoidgehalts und der photosynthetischen Parameter. (A) Chlorophyll- und Carotinoidgehalt in Blättern im Sämlingsstadium der BM-37-Mutante und des WT; (B) Chlorophyll- und Carotinoidgehalt in Blättern im Kopfstadium der BM-37-Mutante und WT (C) Netto-Photosyntheserate (Pn); (D) stomatäre Leitfähigkeit (g); (E) interzelluläre CO2-Konzentration (Ci); (F) Transpirationsrate (E). Alle Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von fünf Wiederholungen dar. Laut Tukey-Test geben Sternchen die statistischen Signifikanzniveaus (*p < 0,05) an.

In WT-Pflanzen und mutierten BM-37-Pflanzen wurden die Expressionsniveaus für verschiedene Gene im Zusammenhang mit der Entwicklung von Chloroplasten, der Photosynthese und der Chlorophyllbiosynthese im Keimlingsstadium bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass Gene, die mit der Biosynthese von Chlorophyll verbunden sind; bestehend aus PORA, CHLD, YGLI, CAO1 und HEMA und den mit der Photosynthese verbundenen Genen wie RbcS, Cab1R, PsaA, PsbA, RbcL und LhcpII39,40, wurden in pyl-v37-Mutantenpflanzen signifikant herunterreguliert als in den WT-Pflanzen (Abb. 7A, B).

Quantitative Expressionsanalyse von Genen im Zusammenhang mit (A) Chlorophyll-Biosynthese, (B) Photosynthese und (C) Chloroplastenentwicklung in den BM-37-Mutanten- und WT-Pflanzen. Das Expressionsniveau jedes Gens wurde durch qPCR analysiert.

Wir untersuchten auch das Expressionsniveau verschiedener Gene im Zusammenhang mit der Chloroplastenentwicklung, einschließlich RpoA, RpoB, OsRpoTp, Rps7, Rps20, RNRL, RNRS, OsPolP1, FtsZ und Rpl2141,42,43,44,45,46. Die relativen Expressionsniveaus aller mit der Chloroplastenentwicklung assoziierten Gene waren in der BM-37-Mutante im Vergleich zu WT-Pflanzen deutlich herunterreguliert (Abb. 7C). Unter abiotischem Stress ist es möglich, dass die fehlerhafte Expression dieser wichtigen Gene den mutierten Phänotyp verursacht hat. Die Ergebnisse zeigten, dass die BM-37-Mutation einen signifikanten Einfluss auf den Metabolismus von Chlorophyll, die Photosynthese und die Chloroplastenentwicklung in BM-37-Mutantenzellen hatte.

Die BM-37-Mutante und die WT-Blätter im Sämlingsstadium wurden verwendet, um die Konzentrationen der häufigsten wachstumsbezogenen Phytohormone wie SA, CK, GA und ABA in der Pflanze zu bestimmen. Den Ergebnissen zufolge waren die CK-Werte wesentlich niedriger und die GA- und SA-Gehalte im BM-37-Mutanten signifikant höher als im WT, während sich die ABA-Werte nicht signifikant von denen des WT unterschieden (Abb. 8A – D). Den Ergebnissen zufolge zeigte die BM-37-Mutante eine effiziente hormonelle Signalübertragung für die Chloroplastenbildung.

Endegene Phytohormone, enzymatische Antioxidantien, Antioxidantien mit niedrigem Molekulargewicht (LMWAs) und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in BM-37-Mutanten und WT. (A) CK-Cytokinine; (B) ABA-Abscisinsäure; (C) SA-Salicylsäure und (D) GA-Gibberellinsäure; (E) SOD-Superoxiddismutase; (G) APX-Ascorbatperoxidase; (I) POD-Peroxidase; (K) CAT-Katalase; (F) TFC-Gesamtflavonoidgehalt; (H) TPC-Gesamtphenolgehalt; (J) H2O2-Wasserstoffperoxid- und (L) MDA-Malonaldehyd-Gehalt. Alle Werte sind der Mittelwert ± SD von drei biologischen Replikationen. * p < 0,05 nach Tukey-Test.

Wir haben auch ROS, wie die H2O2-Produktion und den MDA-Gehalt, sowie deren Fänger-Antioxidantien, wie Antioxidantien mit niedrigerem Molekulargewicht und enzymatische Antioxidantien, untersucht, um die Aktivitäten von Antioxidantien zum Vergleich zwischen WT- und BM-37-Mutanten zu untersuchen (Abb. 8E– L). Enzymatische Antioxidantien wie CAT und APX, die in Blättern von BM-37 deutlich niedriger sind, während SOD in Blättern von WT deutlich höher ist, könnten die oxidativen Verbindungen abfangen (Abb. 8E, G, K). Die MDA-Spiegel waren in BM-37-Pflanzen wesentlich erhöht als in den WT-Pflanzen (Abb. 8L), was zeigt, dass mutierte Blätter mehr oxidative Schäden aufwiesen. Die Ergebnisse zeigten auch, dass es keine nennenswerten Änderungen zwischen den BM-37- und WT-Werten für H2O2 und POD gibt (Abb. 8I, J). Die Ergebnisse zeigten auch, dass die Werte von TFC und TPC in mutierten BM-37-Blättern im Vergleich zu WT-Blättern ebenfalls signifikant verringert waren (Abb. 8F, H). Die Studie ergab, dass BM-37 über eine unzureichende antioxidative Abwehr verfügt, da es weniger wirksam als der WT ist, um von defekten Chloroplasten erzeugte ROS abzufangen.

Für die Genmarkierung ist die Insertionsmutagenese durch T-DNA, Tos17 oder Maistransposons, Ac/Ds und En/dSpm sehr nützlich, der Hauptnachteil ist jedoch das häufige Vorhandensein somaklonaler Variationen. Die Häufigkeit der Genmarkierung durch das endogene Retrotransposon Tos17 ist sehr gering47,48. Mutationen durch Einfügen endogener DNA-TEs sind wünschenswert, um mit Transposonen markierte mutierte Ressourcen zu produzieren. Der einzige Nachteil einer endogenen DNA-TE besteht darin, dass durch Fußabdrücke stabile Mutanten erzeugt werden. In diesem Fall ist es schwierig, das mutierte Gen zu identifizieren. Zuvor wurden Versuche unternommen, mPing, ein touristenähnliches Mitglied der MITE-Familie, im Reisgenom durch Gewebekulturtechniken49,50 und Gammastrahlenbestrahlung51,52,53 zu reaktivieren. Die Insertion von mPing induzierte Duplikationen der Targeting Site (TSDs) von TTA oder TAA, und mPing neigt normalerweise dazu, in die nicht-kodierende Region oder das Intron einzufügen, sodass mPing nicht als gutes Transposon-Tagging-Tool angesehen wurde. Andererseits wurden DNA-TEs, nDat1-0, in Reis entdeckt9. Strukturell ist nDart1-0 ein nicht-autonomes aktives DNA-Transposon mit geringer Größe (607 bp) und sehr reichem GC (ca. 72 %). Es neigt zur Transposition in Genregionen und trägt ein 19 bp großes perfektes Terminalsegment Inverted Repeats (TIRs), die normalerweise 8-bp-hohe GC-Zielstellenduplikationen aufweisen und zur hAT-Superfamilie gehören 54, 55. Es wurde auch festgestellt, dass das in OsClpP5 eingefügte nDart1-0 in zwei andere Gene eindringt, was auf seine hohe Effizienz bei der Genmarkierung hinweist9. Die Explosionssuche ergab, dass die Nipponbare- und Indica-Sorte 9311 13 bzw. 7 nDart1-Homologe trägt. Die effiziente Nutzung von nDart1-0 für die Genmarkierung hängt normalerweise vom Vorhandensein oder Vorkommen von aDart in dieser Reissorte ab. Es wurde beobachtet, dass Nipponbare 63 Kandidaten für das autonome Element aDart56 trägt. Diese spezifischen Merkmale unterscheiden nDart1-0 von den meisten der letzten und früheren Studien und Entdeckungen nicht autonomer transponierbarer Elemente in der DNA.

Die transponierbaren Elemente verursachten Panaschierung oder Albino-Pflanzen, wenn diese Elemente in Reissorten zum Ausdruck kamen57. In Mais und Antirrhinum majus wurde über die Transposon-Tagging-Gene berichtet, die zusammen mit verschiedenen Bereichen transponierbarer Gene oder Elemente erfolgreich isoliert werden konnten58,59,60. Daher haben wir eine Strategie entwickelt, um Gene zu markieren, die durch die Invasion von nDart1-0 mutiert wurden. Die neu entwickelte Strategie mit iPCR (n1-0SPiPCR) ist nützlich für unser nDart1-0-spezifisches Tagging-System. Bei diesem System werden die Transposonelemente normalerweise durch eine inverse PCR durch Restriktion-Ligation-Restriktion-vermittelt markiert, die von bestimmten Transposonsequenzen ausgeht und den Teil der flankierenden Sequenzen zur Restriktion an einer bestimmten Stelle amplifiziert. Die resultierenden PCR-Produkte können zum Klonen, Analysieren oder Sequenzieren verwendet werden61,62,63. In früheren Studien wurde herausgefunden, dass sich sowohl aDart als auch nDart1-0 als nützliches Werkzeug für die Genmarkierung bei Japonica- und Indica-Reisarten erwiesen haben. Wir haben herausgefunden, dass die Verwendung eines gut etablierten systematischen und rechnerischen Ansatzes zur Isolierung des aktiven Transposonelements nDart1-0 aus dem Genom der Wirtszelle dazu beitragen kann, das Vererbungsmuster transponierbarer Elemente in Reis zu verstehen64,65. Diese Technik ist jedoch nicht nur die schnelle Methode zum Nachweis von nDart1-0, sondern kann auch bei der Genmarkierung verschiedener Gene im Reisgenom eingesetzt werden.

Die Albino- oder bunten Mutantenpflanzen liefern wichtige und wertvolle Informationen über das Wachstum und die Entwicklung von Plastiden; Ihre genetische Analyse war aufgrund ihrer höheren tödlichen phänotypischen Wirkung schwierig66. In der vorliegenden Studie konnte das mutierte Allel mithilfe des kürzlich entwickelten Verfahrens namens nDart1-0-iPCR erfolgreich identifiziert werden. Beim Markieren der Zeile nDart1/aDart1 wurde festgestellt, dass sie das häufigste und am häufigsten vorkommende transponierbare Element nDart1-0 enthielt, während die andere Zeile transponierbare Elemente nDart1 enthielt67,68. Es wurde festgestellt, dass transponierbare nDart1-Elemente ihr Verhalten zeigten, sich in die Promotorregionen von Genen zu integrieren69. Es wurde auch festgestellt, dass die Insertion von nDart1-0 eine Ursache für eine Mutation im GTP-Gen 13 bp stromabwärts vom Initiations-ATG-Codon des GTP-Gens ist. Aufgrund der nDart1-0-Insertion stromabwärts der Transkriptionsinitiationsstellen des GTP-Gens kam es zu einer Frameshift-Mutation im GTP-Gen. Die Ergebnisse früherer Forschungsexperimente haben auch gezeigt, dass die nDart1-Insertion an den Transkriptionsinitiationsstellen Auswirkungen auf die Expressionsniveaus in stromabwärts gelegenen Genstellen hatte. Das OsClp5 hat seine Wirkung gezeigt, die durch die Insertion an der 5'-UTR-Position des nDart1-Transposons in der pyl-v-Mutante70 unterbrochen wurde. Es wurde festgestellt, dass die mutierte Reislinie einen erhöhten und verstärkten Blütenstand aufwies, was darauf hindeutet, dass die nDart1-0-Insertion zu einem hochregulierten Niveau der Genexpression von stromabwärts gelegenen Stellen von Gennamen wie Aberrant Panicle Organization1 in Reis führen kann71,72,73.

Aus verschiedenen Forschungsstudien geht hervor, dass das GTP-Protein in größeren Mengen für die Biogenese von Chloroplasten und in geringeren Mengen für die Etioplasten-Biogenese benötigt wird. Es wurde festgestellt, dass die Translationseffizienz von GTP während der Chloroplastenentwicklung vom Etioplasten aus aktiviert wird. Die Zellteilung von Plastiden erfolgte meist im Zeitraum P0 bis zu den sehr frühen P4-Wachstumsstadien, während die Aktivierung des Photosyntheseapparats während des P4-Wachstumsstadiums von Reispflanzen festgestellt wurde74,75,76. Unsere aktuelle Studie legt nahe, dass das GTP-Protein aufgrund eines gut etablierten genetischen Systems von Plastiden während der Entwicklung von Thylakoidmembranen von Chloroplasten funktioniert. In den nichtgrünen Pflanzengeweben wurde auch festgestellt, dass die GTP-Proteinhäufigkeit und -akkumulation während der Chloroplastenentwicklung auf der posttranskriptionellen Ebene reguliert wurde.

Die BM-37-Mutante mit der Insertion von nDart1-0 weist im Sämlingsstadium einen geringeren Gehalt an Carotinoid und Chlorophyll auf, und eine starke Verringerung des Pigments würde sich wahrscheinlich auf die Chloroplastenentwicklung und letztendlich auf den Photosyntheseprozess auswirken (Abb. 6A). Transmissionselektronenmikroskopie bestätigte ultrastrukturelle Veränderungen in BM-37 aufgrund einer Mutation des nDart1-0-Gens (Abb. 5). Bei BM-37 wurde eine höhere Anzahl von Plastoglobuli beobachtet, was mit früheren Untersuchungen übereinstimmt, wonach die Anzahl der Plastoglobuli zunahm, wenn Mutanten einen Defekt in der Biogenese der Thylakoidmembran hatten und ihre Bildung Thylakoid vor oxidativen Schäden schützte77. In BM-37 enthielt der Chloroplasten kleinere Stärkekörnchen, was darauf hindeutet, dass die Stärkebildung gestört war, was sich auf die Energieversorgung für die Entwicklung des Chloroplasten auswirkt78. Darüber hinaus hat die Verringerung des Chlorophyllgehalts der BM-37-Mutante die wichtigsten Photosyntheseparameter wie die Netto-Photosyntheserate, die stomatale Leitfähigkeit, die Transpirationsrate und die interzelluläre CO2-Konzentration verringert (Abb. 6C–F), was auch bei Mutanten mit Gas beobachtet wurde Die Austauschparameter (Pn, Tr, g und Ci) nahmen mit der Verringerung des Chlorophyllgehalts ab79. Darüber hinaus haben niedrigere Transkriptniveaus von Genen, die an der Entwicklung von Chloroplasten, der Chlorophyll-Biosynthese und der Photosynthese der BM-37-Mutante beteiligt sind (Abb. 7A – C), den Beweis erbracht, dass die Mutation in nDart1-0 die retrograde Signalübertragung von Plastid zu Zellkern gestört hat im Einklang mit der vorherigen Feststellung, dass die retrograde Signalübertragung von Chloroplasten auch in der spc1-Mutante von Arabidopsis80 gestört war. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Mutation in BM-37 mit der Chloroplastenentwicklung und der Photosyntheseeffizienz verbunden ist.

Die mutierten BM-37-Pflanzen im Sämlingsstadium führten zu einer erheblichen Verringerung des Chlorophyll- und Carotinoidengehalts, was zu einer beeinträchtigten Chloroplastenentwicklung führte, die zu einer höheren ROS-Anhäufung führen konnte. Carotinoide bieten Schutz vor photooxidativen Schäden durch die Entgiftung überschüssiger freier Radikale und reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)81. Beispielsweise führten eine beeinträchtigte Chloroplasten-Biogenese im Blatt-Buntreis-Zebra225 sowie eine Mutation in ACD2, das für die rote Chlorophyll-Katabolit-Reduktase82 kodiert, zu einer übermäßigen Anreicherung von ROS. Pflanzen produzieren antioxidative Enzyme, um ROS zu entgiften, wie z. B. SOD, um Superoxide zu bewältigen, während CAT, POD und APX H2O2 abfangen. Darüber hinaus wurde berichtet, dass nicht-enzymatische Antioxidantien bei höheren ROS-Werten zu Monodehydroascorbat oxidiert werden können83. Dementsprechend zeigten unsere Ergebnisse einen geringeren Gehalt an nicht-enzymatischen Antioxidantien (Abb. 8F, H) in mutierten BM-37-Pflanzen. Daher lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass eine Fehlfunktion der ROS-abfangenden Enzyme und die Ansammlung von H2O2 und MDA aufgrund einer beeinträchtigten Chloroplastenentwicklung zur gelben Blattfarbe der BM-37-Mutante im Sämlingsstadium geführt haben.

Unter verschiedenen abiotischen Belastungen entstehen in Kulturpflanzen reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Lipidperoxidation, die Schäden in den Zellen verursachen und zum Absterben von Kulturpflanzen führen. Die Verringerung des Wachstums resultiert aus zellulären und subzellulären Anomalien in Pflanzenzellen84,85,86. Jede Kulturpflanzenzelle hat die Fähigkeit, Antioxidantien (SOD, POD, CAT und APX) zu produzieren, um den Selbstverteidigungsmechanismus in der Zelle zu induzieren, insbesondere für Chloroplasten und Mitochondrien87,88. Die reaktive Sauerstoffspezies (H2O2) wirkt sich hauptsächlich auf die Membranen von Chloroplasten und Mitochondrien aus, was letztendlich zum Zelltod führte. Die Produktion von Peroxidase (POD), Katalase (CAT), Guajakolperoxidase (GPOD), Wasserstoffperoxid (H2O2), Superoxiddismutase (SOD), Lipoxygenase (LOX), Katalase (CAT), Ascorbatperoxidase (APOD) und Glutathion-S -Transferase (GST), Glutathion, Prolin, Ascorbinsäure usw. sind bioorganische Verbindungen, die in Zellen produziert werden89,90. Die GTP-Proteine ​​bieten eine Umgebung, in der diese Antioxidantien unter verschiedenen Bedingungen wirken können. Die GTP-Proteine ​​sind in den Zellen lokalisiert, wo Stresszustände bekämpft werden müssen. Die Untersuchung verschiedener Studien zur pflanzlichen Hormonregulation und G-Protein-Signalisierung zeigt mehrere interessante Ähnlichkeiten in ihren funktionellen Rollen. Darüber hinaus zeigen Arabidopsis-G-Protein-Mutanten veränderte Phänotypen als Reaktion auf verschiedene Pflanzenhormone91,92 und Transkriptomdaten zeigen eine signifikante Veränderung der Expression von G-Protein-Genen unter verschiedenen Hormonbehandlungen93. Aus diesen Studien wird geschlossen, dass das Transposon nDart1 -0 ist ein nützliches System zur Entwicklung von Mutanten für die funktionelle Genanalyse, und n1-0 SPI PCR ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur Analyse von Mutanten, die durch die Insertion des Transposons nDart1-0 entstanden sind. Die Transkripte des GTP-bindenden Proteins wurden in verschiedenen Pflanzengeweben beobachtet, üblicherweise in den frühen Pflanzenstadien. Das Era-ähnliche GTP-Bindungsprotein ist ein neues Mitglied einer alten Familie und für die Chloroplastenbiosynthese und das Überleben der Pflanzen von entscheidender Bedeutung.

Diese Studien kommen zu dem Schluss, dass das Transposon nDart1-0 ein nützliches System zur Entwicklung von Mutanten für die Genfunktionsanalyse ist und dass die n1-0-SPI-PCR ein leistungsstarkes Werkzeug zur Analyse von Mutanten ist, die durch die Insertion des Transposons nDart1-0 entstanden sind. Die Transkripte des GTP-bindenden Proteins wurden in verschiedenen Pflanzengeweben beobachtet, üblicherweise in den frühen Pflanzenstadien. Das Era-ähnliche GTP-Bindungsprotein ist ein neues Mitglied einer alten Familie und für die Chloroplastenbiosynthese und das Überleben der Pflanzen von entscheidender Bedeutung. Das beschriebene Protokoll kann als potenzielle Methode zur Identifizierung transponierbarer Elemente aus anderen Organismen, einschließlich Pflanzen wie Mais, hilfreich sein. Man hätte jedoch hoffen können, dass diese Technik nicht nur die schnelle Methode zum Nachweis von nDart1-0 beschreibt, sondern auch seine Verwendung beim Gen-Tagging für verschiedene Gene im Reisgenom.

Alle generierten oder analysierten Daten wurden im Manuskript und in den Zusatzdateien bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde vom Wissenschafts- und Technologiebüro der Provinz Zhejiang, China (Projekt-Nr. 2021C02063-6) und vom DOE Office of Science, Office of Biological and Environmental Research (BER), Vereinigte Staaten, mit den Zuschussnummern DE- unterstützt. SC0006634 und DE-SC0012379

Abteilung für Agrarwissenschaften, Zhejiang-Universität, Hangzhou, 310058, Zhejiang, China

Sanaullah Jalil, Asad Ullah Khan, Muhammad Mudassir Nazir, Sharafat Ali und Xiaoli Jin

Institut für Pflanzenwissenschaften, National Agricultural Research Center, Islamabad, 44000, Pakistan

Sanaullah Jalil

Abteilung für Pflanzenzüchtung und Genetik, Fakultät für Agrarwissenschaften, Universität Punjab, Lahore, 54590, Pakistan

Qurban Ali und Muhammad Arshad Javed

Abteilung für Gartenbauwissenschaften, Fakultät für Landwirtschaft und Umwelt, The Islamia University of Bahawalpur, Bahawalpur, 63100, Pakistan

Faisal Zulfiqar

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SJ, Konzeptualisierung, Untersuchung, Verfassen des Originalentwurfs; Qualitätssicherung, Konzeptualisierung, Untersuchung; AUK, FZ, SA, MAJ und MMN, Überprüfung, Bearbeitung. Formale Analyse; XJ, Supervision, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Xiaoli Jin.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Jalil, S., Ali, Q., Khan, AU et al. Molekulare und biochemische Charakterisierung von Reis, entwickelt durch konventionelle Integration des nDart1-0-Transposon-Gens. Sci Rep 13, 8139 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35095-7

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Eingegangen: 21. Juli 2022

Angenommen: 12. Mai 2023

Veröffentlicht: 19. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35095-7

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